Almeida, Rodrigo Freire Martins deBento-Oliveira, Andreia2025-07-252025-07-252025-04-142024-05-31http://hdl.handle.net/10400.5/102430The search for new antifungal drugs is a relevant and timely subject due to fungal resistance to antimicrobial agents which is an emerging public health threat. Recently developed diphenylphosphane derivatives of ketoconazole exhibited potential as antifungal therapeutic agents. The mode of action of these compounds is not yet fully uncovered, although evidence suggests that they might interact with sphingolipids in the fungal membrane, which are major component of sphingolipid-enriched gel domains (SLEDs). Moreover, it was shown that the antifungal polyene nystatin has pore-forming activity in highly ordered gel membranes that do not contain sterols, contradicting the classical ergosterol-dependent mode of action. Hence, SLEDs which are not found in animal membranes are promising targets for antifungal drugs and are possibly involved in certain antifungal drug action and resistance mechanisms. The objectives of this thesis were 1) to explore the biophysical properties of the plasma membrane of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae focusing on SLEDs, and 2) to uncover the preferential interaction of ketoconazole and diphenylphosphane derivatives, and nystatin with membranes containing specific fungal lipids and distinct biophysical properties as compared to mammalian ones, correlating this interaction with the drugs activity. Fluorescence spectroscopy was used together with an array of membrane systems, from intact cells in suspension to simpler systems such as isolated plasma membrane and liposomes prepared from S. cerevisiae lipid extracts or synthetic lipids. For ketoconazole derivatives, this work also allowed to unravel how structural differences influence their interaction (partition and relative distribution) with membranes and how that could correlate with their biological activity through direct interference on the permeability of the plasma membrane. Overall, the results presented herein point to SLEDs as promising targets for antifungal agents, with potential to uncover new approaches to fight antifungal drug resistance.A resistência a fármacos por parte de fungos patogénicos e o aumento significativo de infeções fúngicas mundialmente são problemas graves para a saúde pública. A procura, desenvolvimento e/ou melhoria de antifúngicos para combater esta ameaça torna-se imperativa. Como novos derivados difenilfosfano do cetoconazol apresentam potencial como antifúngicos, o seu modo de ação deve ser estudado aprofundadamente. Evidências sugerem que estes compostos interagem com esfingolípidos na membrana plasmática de fungos, i.e. com domínios ricos em esfingolipidos (SLEDs). Foi demonstrado que o antifúngico polieno nistatina forma poros em membranas altamente ordenadas, mas que não contêm esteróis, o que contradiz o modelo clássico de ação desta molécula dependente do ergosterol. Uma vez que os mesmos SLEDs não foram encontrados na membrana plasmática de mamíferos, estes domínios são alvos terapêuticos promissores, sendo relevante o estudo das suas propriedades. O objectivo desta tese foi estudar as propriedades biofísicas da membrana plasmática da levedura Saccharomyces cerevisiae com foco nos SLEDs. Em parelo, foi averiguada a interação do antifúngico cetoconazol e seus derivados difenilfosfano, e da nistastina com membranas compostas por lípidos encontrados em membranas de fungo vs de mamífero com propriedades biofísicas próprias. A interação distinta destes compostos foi correlacionada com a sua actividade antifúngica. Para atingir estes objectivos, foi usada espectroscopia de fluorescência em conjunto com uma panóplia de sistemas membranares: de células intactas em suspensão a sistemas modelo com lípidos sintéticos ou extraídos da levedura. Adicionalmente para os derivados do cetoconazol, os resultados apresentados demonstram como as diferenças estruturais entre compostos influenciam a sua interação (partição e distribuição transersal) com membranas, correlacionando esta interação com a sua atividade através da alteração da permeabilidade da membrana plasmática. Assim, os resultados deste trabalho corroboram o potencial dos SLEDs como alvos terapêuticos. Este estudo apresenta, portanto, o potencial de contribuir para o combate às infeções fúngicas.engAntifungal agentsYeast plasma membraneFluorescence techniquesSphingolipidsMembrane-drug interactionAntifúngicosMembrana plasmática da leveduraFluorescênciaEsfingolípidosInteração fármaco-membranadoctoral thesis101667604