Nitric oxide interaction with simple iron-sulfur proteins

Abstract

O óxido nítrico (NO) é uma pequena molécula sinalizadora que emergiu como um importante ubíquo mediador biológico, desempenhando um papel funcional em diversos processos, tais como interacções patogénico-hospedeiro. A acção citotóxica da resposta imune é frequentemente atribuída ao NO devido ao resultado da reacção do óxido nítrico com o superóxido (O2-), formando o peroxinitrito (ONOO-), um potente e tóxico oxidante. O que faz com que o NO seja um mensageiro intracelular muito útil é a sua habilidade para se difundir rapidamente através da maioria das células e tecidos, levando a que haja um menor consumo ou reacção directa. O NO pode actuar como mensageiro e antioxidante, participando na manutenção da homeostasia, particularmente no sistema imune e no sistema nervoso central. Uma perturbação na homeostase do NO está associada com um elevado número de doenças, tais como doenças neuro degenerativas ou diabetes. A formação desregulada de NO e espécies reactivas de azoto (RNS) leva ao stress nitrosativo. Uma vez que o NO é um mecanismo de defesa contra patogénicos, as bactérias frequentemente possuem metaloproteínas, um dos principais objectos de estudo desta tese, que podem ter um papel na destoxificação do NO como reductases do óxido nítrico (NORs). As proteínas flavodiférricas (FDPs) são uma família de proteínas amplamente encontradas em procariontes e também em eucariontes, particularmente em protozoários anaeróbios e organismos fotossintéticos à qual tem sido proposto um papel de protecção dos micróbios contra O2 e NO. Esta família é caracterizada por um domínio flavodiférrico (FDP-D) composto por um domínio flavodoxina C-terminal (que liga FMN), fundido com um domínio metalo-β-lactamase, que liga um centro diférrico não-hémico (o centro activo de redução de NO e/ou O2) com resíduos carboxilato e histidina na primeira esfera de coordenação do ferro. As proteínas flavodiférricas têm em comum o núcleo estrutural composto por aqueles dois domínios, podendo ter igualmente um domínio C-terminal extra fundido a este domínio flavodiférrico. A classificação destas FDPs é baseada nesses domínios extra, e inclui a divisão em pelo menos quatro classes diferentes, A, B, C e D. A natureza destes domínios extra reflecte-se na composição das cadeias de transferência electrónica que acoplam a oxidação do NAD(P)H à redução do NO ou O2. A flavorubredoxina de Escherichia coli (FlRd) é uma proteína modular, uma FDP de classe B, composta pelo núcleo estrutural flavodiférrico e um domínio rubredoxina (Rd) fundido no C-terminus, o qual contém um ferro coordenado por quatro cisteínas [Fe-Cys4]. Estudos in vivo e in vitro com a FlRd propõem que este enzima tem a capacidade de reduzir o NO, com a demonstração de que a FlRd pode ligar o óxido nítrico no centro diférrico. Até agora, esta é a única FDP descrita como tendo actividade exclusiva de reductase de NO. A FlRd, no genoma de E. coli, é codificada pelo gene norV, de reductase do óxido nítrico (NOR). Foi demonstrado que este gene é induzido pelo NO e que confere protecção contra o stress nitrosativo a enzimas metabólicos importantes. Em E. coli, este gene encontra-se adjacente do gene norR, um sensor de NO. Tanto o norV como o norR, em condições anaeróbias, conferem protecção contra o NO a enzimas metabólicos importantes. O gene norW codifica para o parceiro redox da FlRd, uma NADH oxidase (que liga FAD) denominada NADH: flavorubredoxina oxidoreductase (FlRd-red), o qual é capaz de transferir electrões do NADH para o domínio rubredoxina (D-Rd) da FlRd. NorV e norW formam uma unidade dicistrónica, regulada por NorR, que é transcrito na direcção oposta. Devido à elevada complexidade do arranjo modular da FlRd, duas versões truncadas são frequentemente utilizadas no seu estudo: FDP-D, que corresponde ao núcleo flavodiférrico, e o Rd-D, que consiste somente no domínio rubredoxina da FlRd. A rubredoxina tem um papel fundamental no processo de destoxificação do NO uma vez que é o ponto de entrada dos electrões na FlRd, podendo igualmente funcionar dador fisiológico de electrões para diversas outras proteínas flavodiférricas. Estudos espectroscópicos podem ser utilizados para melhor compreender o comportamento e contribuição de cada domínio na proteína intacta. Nos espectros de absorção das FDPs na forma oxidada, na região do visível e ultravioleta próximo, os espectros são dominados pelo cofactor flavínico (bandas características a ~380nm e ~460nm). As FDPs de classe B têm a contribuição do centro rubredoxina, [Fe-Cys4], com a banda a ~460nm a deslocar-se para ~470nm, e a formação de uma nova banda a ~570nm. Esta larga banda deve-se quase exclusivamente ao domínio rubredoxina, o que é importante para se perceber o comportamento funcional dos diferentes cofactores. A ressonância paramagnética electrónica (EPR) é a principal espectroscopia utilizada para identificar e estudar em detalhe o centro diférrico das FDPs. Este centro pode existir em três estados de oxidação diferentes: diférrico (Fe(III)-Fe(III)), valência mista (Fe(III)-Fe(II)) e diferroso (Fe(II)-Fe(II)). O estado diférrico é silencioso em EPR, uma vez que os dois iões ferro (spin alto, S=5/2) estão antiferromagneticamente acoplados, resultando no spin total S=0. Neste estado, apenas as FDPs que têm um domínio rubredoxina é que são activas em EPR, apresentando um sinal típico de spin alto, S=5/2 Fe(III), com a ressonância característica a valores de g ~4.3. Quando se reduz a proteína, o sinal desaparece uma vez que o spin muda para S=2. O centro diférrico só é claramente detectado por EPR no estado de valência mista reduzido com um electrão, apresentando um sinal rômbico com valores de g<2.0, com intensidade máxima a 7K. A redução completa do centro diférrico (Fe(II)-Fe(II)) resulta no desaparecimento deste sinal, aparecendo um sinal a g~11, indicando um estado de spin S=4. O NO pode ser produzido como um intermediário no processo de desnitrificação, ou como produto de NO sintetases de macrófagos, devido à resposta imune contra patogénios. Com isto, FDPs como a FlRd de E. coli (o primeiro membro desta família a ser reportado como reductase do NO) são uma das principais defesas dos micróbios contra os efeitos citotóxicos do NO, neutralizando a resposta do sistema imunitário. Até agora, a expectativa relativamente à reacção do NO com a FlRd era que o NO fosse reagir directamente com o centro diférrico. No entanto, foi sugerido que o domínio rubredoxina pudesse igualmente desempenhar um papel na redução do NO. Assim, o principal objectivo desta tese foi analisar a reactividade do domínio rubredoxina com a molécula de NO. Para isto, o efeito do NO em diferentes rubredoxinas (domínio rubredoxina de E. coli e a rubredoxina de Desulfovibrio gigas) foi estudado por métodos espectroscópicos e por ensaios cinéticos. Uma comparação entre as sequências de aminoácidos de ambas as rubredoxinas foi realizada. O alinhamento das sequências mostrou que a distância entre os dois pares de cisteínas permanece conservada, CxxC-X29-CxxC. Além disso, a distância entre as cisteínas dentro do par é idêntica, CxxC. O alinhamento apresenta uma identidade de 37% e similaridade de 55% entre as sequências. Apesar deste resultado apontar para um elevado nível de semelhança entre sequências, ao mesmo tempo deixa a possibilidade de haver uma reactividade diferente entre cada rubredoxina e o óxido nítrico. Nos ensaios de UV-Visível com as proteínas na forma oxidada, os resultados sugerem que as rubredoxinas não estão a reagir com o NO, e que as diferenças espectrais observadas são devidas à contribuição do espectro do NO livre. Por outro lado, os resultados obtidos com as proteínas na forma reduzida revelaram que, neste estado, as rubredoxinas reagem com NO. No entanto, uma ligeira diferença é observada entre as duas rubredoxinas. Enquanto a reoxidação do domínio rubredoxina com NO aparenta originar a formação de duas espécies oxidadas distintas a concentrações de NO diferentes, possivelmente devido à ligação de uma, e posteriormente duas moléculas de NO, no caso da rubredoxina de D. gigas aparentemente só se forma uma espécie oxidada, que é semelhante à espécies nativa da proteína. No interior da célula o NO reage primariamente com proteínas que contêm metais, de entre as quais proteínas com centros Fe-S. O que usualmente acontece nestes centros é o seu desmantelamento, levando à formação de complexos de ferro di-nitrosilados (DNICs). A formação dos DNICs foi analisada por EPR, uma vez que apresentam um sinal axial característico a g=2.03, uma marcador biológico da degradação de proteínas Fe-S mediada pelo NO. Os resultados de EPR mostraram a formação de duas espécies diferentes. Em primeiro lugar, com concentrações de NO mais baixas, um sinal a valores de g~4 foi observado, correspondendo ao complexo Fe(II)-NO. Com concentrações crescentes de NO, o sinal característico dos DNICs começa a formar-se, correspondendo ao complexo Fe(III)-(NO)2. Os ensaios cinéticos realizados com o eléctrodo de NO, com o objectivo de determinar o consumo de NO por cada rubredoxina, revelaram que o domínio rubredoxina é bastante mais reactivo com o NO que a rubredoxina de D. gigas. Os resultados aqui presentes para o domínio rubredoxina truncada da flavorubredoxina de Escherichia coli e para a rubredoxina de Desulfovibrio gigas são discutidos na perspectiva de um papel na destoxificação do óxido nítrico. Esta tese permitiu compreender melhor a reactividade destas rubredoxinas em condições de stress nitrosativo, assim como o mecanismo pelo qual elas reagem com o óxido nítrico. Com estes resultados é possível sugerir que o domínio rubredoxina pode desempenhar um papel na actividade de reductase de NO da FlRd.

The Flavodiiron proteins (FDPs) family have been assigned to Nitric Oxide and O2 detoxification, affording protection to microbes upon nitrosative or oxidative stress conditions. Escherichia coli Flavorubredoxin (FlRd) was the first member of this family reported as an NO reductase. FDPs are primarily composed by two domains: an N-terminal metalo-β-lactamase like domain harbouring a diiron centre (in which the NO/O2 molecules are reduced) and a C-terminal FMN-binding flavodoxin domain. Many FDPs bear an extra C-terminal domain, involved in the mediation of electron transfer processes. Flavorubredoxin, the FDP from Escherichia coli, has an extra Rubredoxin (Rd) domain fused at the C-terminus, which contains an iron coordinated by four cysteines [Fe-Cys4]. Due to the complexity of the modular arrangement of FlRd, two truncated versions are commonly used for study: FDP-domain (flavodiiron core) and Rubredoxin domain (Rd-D). The rubredoxin has a key role in this process because it is the entry point of the electrons into the FlRd, and a physiological electron donator of several FDPs. Therefore, we studied by spectrophotometric and kinetic assays the effect of NO on different rubredoxins (Escherichia coli flavorubredoxin rubredoxin domain and Desulfovibrio gigas rubredoxin). With the UV-Visible studies we have showed that both rubredoxins only interact with nitric oxide when they are in the reduced state. We also observed the formation of new oxidized species upon incubation with increasing concentrations of NO. These results were confirmed by EPR spectroscopy, with the formation of a new signal characteristic of dinitrosyl iron complexes (DNICs). The Amperometric assays allowed the conclusion that the rubredoxin domain (Rd-D) is more reactive with NO than the D. gigas rubredoxin (Rd).