A new method based on depolarization detection, for quantification of HbSS erythrocytes

Abstract

Introdução: A drepanocitose é uma hemoglobinopatia com significativa morbimortalidade. Métodos de rastreio simples permitem a deteção da HbS polimerizada (visualização de eritrócitos falciformes, solubilidade da HbS), enquanto o diagnóstico definitivo e a monitorização dependem da deteção e quantificação da HbS por eletroforese (ou Cromatografia Líquida de Alta Performance). A HbS forma polímeros birrefringentes que despolarizam a luz, sendo facilmente identificada por microscopia polarizada. Objetivo: Investigar se a despolarização permite a identificação de eritrócitos com HbS e se possui correlação com a HbS. Métodos: Sangue anticoagulado com EDTA de 51 pacientes com drepanocitose foi observado após 24h de incubação, usando a prova de falciformação com metabissulfito. Fotografias de microscopia ótica e polarizada (1000x) de pelo menos 100 eritrócitos foram contadas manualmente usando o software Image J. Uma experiência preliminar investigou se o efeito anti-falciforme do voxelotor poderia ser detetado avaliando a despolarização. Resultados: A microscopia ótica confirmou a presença de células falciformes típicas e outras células deformadas em todas as amostras, que demonstraram fraca correlação com os níveis de HbS. Todos os eventos de despolarização e os eritrócitos deformados despolarizantes mostraram uma alta correlação com a HbS: coeficiente de Pearson de R=0,85 (P<0,001) e R=0,84 (P<0,001), respetivamente. As amostras processadas em dois dias apresentaram a melhor correlação (R=0,94), que diminuiu com os atrasos no processamento. O efeito do voxelotor foi facilmente avaliado com a despolarização através de análise de imagem automatizada. Conclusão: Este novo método deteta HbS despolarizante tanto em eritrócitos deformados como em não deformados, sendo uma ferramenta útil de rastreio. A contagem de células despolarizantes pode permitir determinar aproximadamente a concentração de HbS (%) quantitativamente. Quanto mais recentes as amostras, maior a credibilidade dos resultados. Poderá ser um método simples e fácil, útil em áreas com recursos limitados, para rastreio da drepanocitose e monitorização da HbS.

Introduction: Sickle-cell-disease (SCD) is a hemoglobin disorder (HbS) with significant morbidity and mortality. Simple screening-tests depend on the detection of polymerized HbS (i.e., sickled Red-Blood-Cells, solubility of HbS), while definitive diagnosis and monitoring depend on electrophoretic (or High-Performance-Liquid-Chromatography) detection and quantification of HbS. Polymerized HbS depolarizes light and is easily identified inside Red-Blood-cells (RBCs) by microscopic observation using crossed polarizers. Objective: To investigate if depolarization would allow the identification of HbS containing RBCs and any correlation with HbS. Methods: EDTA-anticoagulated blood from 51 SCD patients were observed after 24h incubation, using the standard metabisulfite sickling test. Photographic images of light and polarization microscopy (1000x) of at least 100 RBCs were manually counted using Image J software. A preliminary experiment investigated if the anti-sickling effect of voxelated could be detected using depolarization. Results: Light microscopy detected typical sickle cells and other deformed cells in all samples but showed only a weak correlation with HbS levels. Depolarizing polymerized HbS could be easily identified in RBCs. All depolarizing RBCs but also depolarizing deformed RBCs showed a high correlation with HbS: Pearson’s coefficient of R=0,85 (P<0,001) and R=0,84 (P<0,001), respectively. Samples processed within two days showed the best correlation (R=0,94) which decreased with delays in processing. The drug effect of voxelotor was easily assessed with depolarization using an automated image analysis. Conclusion: This new method could be a possible screening tool to identify SCD as it detects depolarizing HbS not only in deformed, but also in non-deformed RBCs. Most importantly, counting depolarizing cells may allow to approximately determine the concentration of HbS (%) quantitatively. The observed results are likely even more convincing when fresh samples (same day) are used. This novel method could be a simple and easy POC-test to screen for SCD and monitor the amount of HbS, especially in resource-limited areas.