Novas abordagens para o tratamento da fenilcetonúria: pequenas moléculas moduladoras da atividade e estabilidade da fenilalanina hidroxilase humana

Abstract

A fenilcetonúria (PKU; OMIM #261600) é o erro hereditário mais comum do metabolismo de aminoácidos em populações Caucasianas, afetando cerca de 1 em cada 10.000 recém-nascidos. Esta doença metabólica é caracterizada por mutações no gene PAH, que codifica a enzima fenilalanina hidroxilase humana (hPAH; EC 1.14.16.1). A hPAH é uma enzima homotetramérica, que catalisa a conversão da L-fenilalanina (L-Phe) em L-tirosina (L-Tyr) por para-hidroxilação da cadeia lateral aromática daquele aminoácido. Para que esta reação ocorra, a hPAH requer o cofator tetrahidrobiopterina (BH4), ferro não hémico e oxigénio molecular (O2). Até muito recentemente a terapia dietética era a única abordagem disponível para o tratamento dos doentes PKU, de modo a evitar o desenvolvimento de danos cerebrais irreversíveis. No entanto, e devido à dificuldade em aderir ao tratamento dietético, novas abordagens terapêuticas, menos restritivas, estão em estudo. Sendo a PKU classificada como doença conformacional por loss of function a administração da BH4 como chaperone farmacológico é uma nova abordagem terapêutica recente. No entanto, estes tratamentos estão longe de abranger todo o espectro fenotípico da doença, em especial o fenótipo de PKU clássica, mais grave. Os grupos de Metabolismos e Genética e Química Bio-orgânica do Instituto de Investigação do Medicamento (iMed-ULisboa) têm estado envolvidos no desenvolvimento de compostos que possam ativar e/ou estabilizar a hPAH de modo a constituírem novas abordagem terapêutica da PKU. Com base no conhecimento da estrutura da hPAH postulámos que os derivados de 3-hidroxiquinolin- 2-onas (3-HQs) poderiam ser um modelo útil para o desenho de novos moduladores da atividade e/ou estabilidade desta proteína. Neste trabalho foi constituída uma pequena biblioteca de compostos (derivados da 3-HQ) que foram testados pelo seu efeito na atividade, estabilidade e conformação da hPAH selvagem. Foi ainda avaliada a sua toxicidade celular. Dos 22 derivados 3-HQs, identificamos com sucesso dois conjuntos de moléculas que visam dois modos de ação diferentes atuando como: (i) “chaperones de atividade” pela sua capacidade de pré-ativar a hPAH (C4 / C6 / C12; 1,7 / 1,6 / 1,6 vezes, respetivamente) ou por permitir a ativação pela L-Phe (C5 / C6 / C14 / C16; aumento de 3,2 / 1,5 / 1,7 / 2,0 vezes, respetivamente) e, (ii) “chaperones farmacológicos” uma vez que aumentam a temperatura de desnaturação (Tm) do domínio regulador (C2 / C6 / C13 / C20; aumento do Tm1 de 8,3ºC / 4,0ºC /7,8ºC / 2,6ºC, respetivamente) ou do domínio catalítico (C20 / C21; aumento do Tm2 de 4,2ºC / 2,2ºC, respetivamente) da hPAHwt. Os resultados obtidos neste trabalho, demonstram que o núcleo 3-HQ é um scaffold adequado para o desenho e desenvolvimento de compostos com atividade sobre a hPAH e um excelente ponto de partida para o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos para a PKU.

Phenylketonuria (PKU, OMIN # 261600) is the most common inherited defect of amino acid metabolism in Caucasian populations, affecting about 1 in 10.000 newborns. This metabolic disease is characterized by mutations in the PAH gene, which encodes the human phenylalanine hydroxylase (hPAH, EC 1.14.16.1). The hPAH is a homotetrameric enzyme, which catalyzes the conversion of Lphenylalanine (L-Phe) to L-tyrosine (L-Tyr) by para-hydroxylation of the aromatic side chain of that amino acid. For this reaction to occur, hPAH requires the tetrahydrobiopterin cofactor (BH4), nonheme iron and molecular oxygen (O2). Till very recently, dietary therapy was the only approach available for the treatment of PKU patients in order to prevent the development of irreversible brain damage. However, as adhesion to this dietetic treatment is difficult, new and less restrictive therapeutic approach are under study. Since PKU is classified as conformational disease by loss of function, administration of BH4 as a pharmacological chaperone is recent and innovative therapeutic approach. However, these treatments are far from encompassing the entire phenotypic spectrum of the disease, especially the most severe form (classical PKU). The Metabolism and Genetics (Met&Gen) and Bioorganic Chemistry Groups from the Research Institute for Medicines (iMed.ULisboa), have been involved in the development of compounds that can activate and/or stabilize hPAH to constitute a new therapeutic approach for PKU. Based on the knowledge of hPAH structure, we postulated that 3-hydroxyquinolin-2-ones (3-HQs) derivatives could be a useful scafold for the design of new modulators of the activity and/or stability of this protein. In this work a small library of compounds (3HQs derivatives) was created and was tested for their effect on the activity, stability and conformation of the wild-type hPAH. The cellular toxicity was also evaluated. From the 22 compounds, we successfully identified two sets of molecules targeting two different modes of action: (i) acting as “activity chaperones” for their ability to pre-activate hPAH (C4 / C6 / C12; 1,7 / 1,6 / 1,6-fold, respectively) or to allow L-Phe activation (C5 / C6 / C14 / C16; increase of 3,2 / 1,5 / 1,7 / 2,0-fold respectively), and (ii) acting as “pharmacological chaperones” for their effect upon the thermostability of the hPAH regulatory (C2 / C6 / C13 / C20; Tm1 increase of 8,3 / 4,0 / 7,8ºC / 2,6ºC, respectively) and catalytic domain (C20 / C21; Tm2 increase of 4,2 / 2,4ºC, respectively). The results obtained in this work demonstrate that the 3HQ core is a suitable scaffold for the design and development of compounds with activity on hPAH and an excellent starting point for the development of new therapeutic agents for PKU.