Factors affecting the ZIKV life cycle

Abstract

O vírus Zika (ZIKV) é um arbovírus, isto é, é um vírus transmitido por artrópodes, sendo o seu principal vetor de transmissão o mosquito do género Aedes. ZIKV teve a sua origem na Floresta Zika, na República de Uganda, tendo sido isolado, em 1947, do sangue de um macaco rhesus. Em 1954, foram relatados, na Nigéria, os primeiros casos de humanos infetados com o vírus e, nos 57 anos seguintes, apenas 13 casos foram reportados. O primeiro grande surto surgiu, em 2007, no estado de Yap (Estados federados da Micronésia), atingindo a Polinésia Francesa e o Brasil no ano de 2013 e 2015, respetivamente. O facto do vírus também ser transmitido sexualmente e por transfusões sanguíneas pode promover a sua rápida dissiminação, conduzindo a uma potencial pandemia. Atualmente, a presença do ZIKV já foi documentada na maior parte dos países europeus e nos Estados Unidos da América, mas a sua maior incidência tem lugar em África, América central e do sul, bem como no Pacífico. Somente cerca de 20% das pessoas infetadas com o vírus apresenta manifestações clínicas, sendo que os principais sintomas são febre ligeira, erupções cutâneas, dores de cabeça, dores nas articulações e conjuntivite. Porém, complicações neurológicas como síndrome de Guillain-Barré (GBS) e, em recém nascidos, microcefalia têm sido associadas ao ZIKV. A sua rápida expansão e o aumento de casos de microcefalia levaram a Organização Mundial de Saúde (do inglês: World Heath Organization), em fevereiro de 2016, a declarar a infeção pelo ZIKV um estado de emergência pública. Semelhante a outros flavivírus, o ZIKV é constituído por uma nucleocápside viral composta pela proteína C associada a um genoma de RNA de cadeia simples e polaridade positiva. Esta cápside encontra-se rodeada por uma bicamada lipídica, na qual se encontram ancoradas as proteínas E e M, formando o envelope. O ciclo de vida destes flavivírus começa pela internalização das partículas virais na célula hospedeira, através de endocitose-mediada por recetores. O meio acídico dos endossomas favorece a ocorrência de alterações conformacionais e, consequentemente, na libertação do genoma viral para o citoplasma, onde é traduzido numa poliproteína. Esta poliproteína é, então, processada por enzimas virais e celulares em proteínas estruturais e não estruturais. Enquanto que as proteínas estruturais integram novas partículas virais, as não estruturais participam na replicação viral e na clivagem proteolítica da poliproteína. O ZIKV induz reorganizações do retículo endoplasmático (RE), de modo a formar os locais de replicação. Perto destes locais, as novas partículas virais são montadas e conduzidas para a via secretora, onde, na rede trans-Golgi (do inglês: trans-Golgi network), sofrem maturação e, portanto, tornam-se infeciosas. Depois das partículas virais serem maturadas, estas saem da célula por exocitose. Macroautofagia, mais conhecida por autofagia, é um processo catabólico conservado em células eucarióticas. Este processo celular é responsável pela degradação de proteínas citoplasmáticas e organelos envelhecidos ou em excesso. Deste modo, este sistema é extremamente importante para a manutenção da homeostasia e sobrevivência das células. Sendo um processo altamente regulado, tem capacidade de combater infeções virais através da sua degradação direta nos lisossomas ou estimulando respostas imunes. A relação entre vírus e autofagia ainda não está compreendida na sua totalidade. Curiosamente, vários estudos provaram que os flavivírus aumentam a atividade desta via para seu próprio benefício, promovendo diferentes passos do seu ciclo de vida. Recentemente, partículas do ZIKV foram encontradas em vesículas semelhantes a autofagossomas, associados ao RE. No entanto, a importância desta via para os diversos passos do ciclo de vida do ZIKV está ainda pouco estudada. Desta forma, pretendeu-se investigar a relevância de certos fatores, tais como, a acidificação de compartimentos endossomais-lisossomais, o tráfego de colesterol intracelular e a autofagia, para o ciclo de vida deste vírus. Neste estudo, células epiteliais provenientes de adenocarcinoma de pulmão humano (A549) foram infetadas com duas estirpes do ZIKV isoladas na Polinésia Francesa e na República de Uganda. De modo a compreender como é que a acidificação do lúmen dos endossomas e lisossomas afeta o ciclo de vida do vírus, células infetadas com as estirpes do ZIKV foram tratadas com Bafilomicina A1 (BFLA). Nesta parte do trabalho, tratamento pré-infeção (do inglês: pre-infection) e pós-infeção ( do inglês: post-infection) foram usados com o intuito de perceber como é que este composto interfere com a entrada do vírus nas células hospedeiras e com o desenrolar da infeção, respetivamente. No tratamento pré-infeção, as células foram em primeiro lugar tratadas e, duas horas mais tarde, infetadas com o vírus. Por outro lado, o tratamento pós-infeção, tal como o nome indica, consiste no tratamento das células duas horas após terem sido infetadas. BFLA é um inibidor da bomba de protões V-ATPase, impedindo a acidificação de organelos como, por exemplo, os endossomas e os lisossomas. O tratamento préinfeção impediu a entrada de ambas as estirpes do ZIKV, enquanto que, o tratamento pós-infeção conduziu à diminuição da infeção viral ao longo do tempo. Assim sendo, é possível inferir que a BFLA dificulta a endocitose-mediada por recetores e, quando a infeção já está estabelecida, a acidificação do lúmen dos endossomas e lisossomas é fulcral, tanto no início como no fim do ciclo de vida do ZIKV. Na segunda parte deste trabalho, tentou-se perceber a importância do tráfego de colesterol intracelular para a infeção do vírus. Para tal, células infetadas foram tratadas pré- e pós-infeção com U18666A (U18). U18 bloqueia o tráfego de colesterol intracelular como consequência da sua acumulação em endossomas tardios (do inglês: late endosomes) e lisossomas. Ambas as estirpes revelaram um decréscimo da infeção viral consoante o tempo e bastante semelhante entre os dois tipos de tratamentos aplicados. Contudo, os resultados não permitiram retirar conclusões acerca do passo do ciclo de vida afetado por este inibidor. Por fim, de modo a compreender a influência direta da autofagia para o ciclo de vida do ZIKV, Rapamicina (RAPA) e 3-Metiladenina (3-MA) foram utilizados para tratar células infetadas. Neste caso, apenas tratamento pós-infeção foi necessário, uma vez que estes moduladores não interferem com processos relacionados com a entrada viral. A RAPA é um ativador da autofagia, enquanto que a 3-MA previne a sua iniciação. O seu efeito parece refletir-se, maioritariamente, no aumento do nível da replicação. Tal como sugerido por Liang et al., 2016, o ZIKV aparenta necessitar da via autofágica da célula hospedeira para criar estruturas membranares para os locais de replicação. Em suma, este trabalho permitiu aprofundar a relação entre a autofagia e o ZIKV, podendo contribuir para posteriores estudos a realizar, não só com o ZIKV, mas também com outros flavivírus. Como se veio a demonstrar, a acidificação de compartimentos endosomais-lisosomais é de extrema importância para a entrada viral e para o estabelecimento da infeção. Ficou, igualmente, demonstrado que o tráfego de colesterol intracelular é requerido para poder haver uma eficiente infeção. Porém, estudos adicionais devem ser realizados para clarificar qual ou quais os passos do ciclo de vida é que são afetados. Os resultados obtidos sugerem que a atividade autofágica seja aumentada em células infetadas com o intuito de promover a replicação do ZIKV. Devido à falta de uma vacina ou de compostos específicos com atividade antiviral contra o ZIKV, aliados ao aumento de casos de GBS e microcefalia, esforços devem ser feitos na medida de melhor compreender o ciclo de vida deste flavivírus, bem como, a sua patogenicidade.

The Zika virus (ZIKV) infection has spread widely, mainly in Africa, South and Central America, and South Pacific. This mosquito-borne virus had its first appearance on a rhesus monkey in the Zika forest of Uganda, in 1947. Like other flaviviruses, the ZIKV has a single-stranded positive RNA genome that encodes a polyprotein, which is processed by viral and host proteases. In the context with the epidemic in the South America, a clear correlation between the infection of pregnant women and the development of microcephaly in fetuses was observed. Thus, understanding the life cycle of the virus and discovering ways to reduce or even eradicate the infection of ZIKV has become urgent. Autophagy, as an essential process for the cellular homeostasis and survival, is responsible for the lysosomal degradation of damaged or unwanted cytoplasmic proteins and organelles. The relationship between virus and autophagy is not yet fully understood. Several reports suggest that flaviviruses lead to an increase of autophagic activity to promote different stages of the viral life cycle. The same holds true for ZIKV, as it was shown in infected fibroblasts. However, the relevance of this pathway for the numerous steps of the ZIKV life cycle is poorly studied. To investigate the relevance of autophagy, ZIKV-infected cells were treated with various chemical compounds. In this study, Bafilomycin A1, a V-ATPase inhibitor, was capable to diminish viral infection effectively. Moreover, the intracellular cholesterol transport inhibitor, U18666A, was shown to reduce the spreading of infection. 3-Methyladenine, an early autophagy inhibitor, contributed to a decrease of viral replication, whereas Rapamycin, an autophagy inducer, promoted it. This work provided new insights into the relationship between autophagy and ZIKV infection. Clearly, the acidification of endosomal-lysosomal compartments is extremely important for the entry process and for the establishment of infection. As for the importance of intracellular cholesterol trafficking, further experiments need to be performed to clarify which stages of the ZIKV life cycle are affected. These data suggest that the main influence of autophagy lies in the augmentation of viral replication.