Study of the effect of electrochemical gradients on the function of cytochrome c oxidase using molecular simulation methods

Abstract

A Citocromo c oxidase (Ccox) é um enzima que actua como enzima terminal na cadeia respiratória mitocondrial em organismos eucariotas e procariotas aeróbios. Este enzima é uma proteína de membrana integral, também conhecida como complexo IV da cadeia respiratória mitocondrial, que pertence à superfamília heme-cobre oxidase. A Ccox actua como uma bomba de protões e também desempenha a função de transdutor de energia que utiliza a energia potencial que resulta da transferência de electrões para bombear protões através da membrana em que está inserida, que separa a matriz mitocondrial do espaço intermembranar mitocondrial. Esta transferência de protões é realizada contra um gradiente electroquímico e está acoplada à redução de moléculas de dioxigénio a moléculas de água. A transferência de electrões é vectorial, o que significa que acontece de forma unidireccional. Esta transferência de electrões e o bombeamento de protões através da membrana mitocondrial interna tem como consequência a geração de um potencial de membrana. Além disso, o consumo de protões leva à formação de um gradiente de pH. Ambos estes factores, o potencial de membrana e o gradiente de pH originam um gradiente electroquímico de protões que é, normalmente denominado de força motriz gerada por protões. O trabalho apresentado nesta tese é essencialmente a validação e aplicação preliminar da implementação deste novo método que considera a influência do potencial de membrana em sistemas biológicos, sendo que esta foi a primeira vez que um estudo computacional da influência do potencial de membrana foi aplicado à Citocromo c oxidase. Alguns autores, como Ullmann e o seu grupo, já investigaram a importância e a influência do potencial de membrana e do gradiente de pH em sistemas biológicos. Este grupo, através da utilização de métodos computacionais, determinou que estes factores têm uma grande influência no comportamento e titulação de resíduos tituláveis na Bacteriorodopsina (bR). Esta proteína é bastante conhecida e foi utilizada por nós, nesta tese, como modelo para a validação do nosso novo método de Poisson-Boltzmann/ Monte Carlo que, para além do gradiente de pH, também inclui o potencial de membrana. Para a bR decidimos também testar quatro valores (4, 6, 8 e 10) diferentes de constantes dielétricas a atribuir à proteína. Com os resultados obtidos verificámos que, na maior parte dos resíduos, não havia diferenças significativas entre os valores de constantes dielétricas testados. Assim, como o valor de 10 foi utilizado num dos trabalhos anteriores em que nos baseámos para comparar resultados, decidimos usar este valor para todos os testes feitos. Desta forma, o mesmo valor de constante dieléctrica foi também atribuído à Citocromo c oxidase. Os resultados obtidos para a bR através do nosso método apresentam algumas diferenças face aos resultados obtidos pelo Ullmann e o seu grupo. Estas diferenças pouco significativas, que foram observadas aquando da comparação dos resultados obtidos, podem ter origem em vários factores. Para além de termos introduzido algumas alterações ao método usado por este grupo também os campos de forças utilizados nos cálculos moleculares são diferentes, uma vez que as cargas parciais e os raios atómicos variam entre campos de forças: Ullmann e os seus colaboradores usaram um campo de forças denominado CHARM22 enquanto o nosso método utiliza o GROMOS 54A7. Outra razão para a existência de algumas diferenças é a forma como os resíduos tituláveis foram atribuídos a cada lado da membrana: nós usamos um critério geométrico enquanto Ullmann e os seus colaboradores se basearam em redes de ligações por pontes de hidrogénio. Finalmente, outra razão possível é o facto de nós termos usado uma membrana explícita em que os lípidos carregados podem influenciar o comportamento dos resíduos, enquanto Ullmann e os seus colaboradores usaram “dummy atoms” que não têm carga atribuída e, por isso, não têm a capacidade de estabilizar ou destabilizar as formas protonadas ou desprotonadas que os resíduos proteicos adquirem durante a titulação na presença do gradiente de pH e do potencial de membrana. Devido à importância do papel da Ccox na respiração celular, decidimos aplicar a esta proteína o nosso novo método e comparar os nossos resultados, na presença do potencial de membrana, com resultados obtidos em trabalhos anteriores, desenvolvidos no grupo de Simulação Molecular do ITQB, em que apenas foi contabilizado o efeito do gradiente de pH. Para incluir o efeito da força motriz gerada por protões foram testados dois valores: 150 mV e 200 mV. O valor de 150 mV foi testado porque é, aproximadamente, o valor observado deste parâmetro em várias condições biológicas, enquanto o valor de 200 mV foi testado uma vez que é o valor máximo, geralmente, associado a este parâmetro. No entanto, após os testes iniciais verificámos que não havia diferenças significativas na utilização destes dois valores. Assim, confirmámos que a variação do potencial de membrana entre estes valores seria insignificante e, sendo assim, seria indiferente a utilização de qualquer um deles, sendo que o erro associado à utilização deste parâmetro era reduzido. Decidimos utilizar os resultados a 150 mV como termo de comparação com os resultados obtidos para a influência do gradiente de pH, uma vez que este é o valor associado à Citocromo c oxidase em condições biológicas. Antes da inclusão do potencial de membrana, foi verificado, pelo grupo de Simulação Molecular do ITQB, que o comportamento dos resíduos tituláveis da Ccox era influenciado pelo gradiente de pH. No entanto, os resultados obtidos através deste novo método mostram que alguns desses resíduos se tornam insensíveis ao gradiente de pH quando há um potencial de membrana presente e que a presença deste potencial influencia de forma muito mais acentuada o comportamento dos resíduos tituláveis. Nestes trabalhos anteriores foi sugerido que três dos resíduos cujo comportamento era influenciado pelo gradiente de pH, a valores de pH fisiológicos (GLU-286i , TYC-288i , LYS-362i ), poderiam desempenhar um papel importante num mecanismo regulador próprio da Ccox. No entanto, com a introdução do potencial de membrana, o comportamento desses resíduos sofreu grandes alterações e estes deixaram de titular a valores de pH fisiológicos. Tendo em conta que em condições biológicas normais o potencial de membrana está sempre presente, uma das conclusões que retirámos do trabalho aqui apresentado foi que é pouco provável que estes resíduos, considerados resíduos-chave na Ccox, estejam envolvidos nesse mecanismo regulador. Para além disto, os nossos resultados mostram claramente que a presença de um potencial de membrana, neste tipo de estudos, tem uma grande influência no comportamento dos resíduos tituláveis. Estes factos levam-nos a acreditar que muitos dos valores de determinado através de métodos experimentais ou computacionais, na ausência de um potencial de membrana, podem não ser verificados em condições fisiológicas. Tendo em conta o facto de o trabalho apresentado nesta tese ser essencialmente o primeiro passo após a implementação de um novo método, os resultados aqui apresentados devem ser considerados como uma validação da implementação deste método e como um conjunto de resultados e de conclusões preliminares que tencionamos continuar a explorar de uma forma mais aprofundada, uma vez que não foi possível de o fazer no tempo estabelecido para a realização desta tese. Temos previstas algumas análises futuras para determinação de outras implicações biológicas da presença do potencial de membrana na Citocromo c oxidase, sendo que o objectivo final é integrar esta nova metodologia, aqui apresentada, em simulações de dinâmica molecular a pH constante.

Cytochrome c oxidase (Ccox) is an enzyme that acts as the terminal enzyme of the respiratory chain in eukaryotes and in aerobic prokaryotes. It is an integral membrane protein, also known as complex IV of the mitochondrial respiratory chain, and belongs to the heme-copper oxidase superfamily. Ccox is a membrane-bound redox-driven proton pump that plays the role of an energy transducer that uses the potential energy of electron transfer to move protons across the membrane, against an electrochemical gradient and couples that process with dioxygen reduction to water. The vectorial electron transfer and proton pumping that occur generate a membrane potential, and the consumption generates a pH gradient. Both of these give rise to an electrochemical proton gradient, also known as protonmotive force. Given the importance of these parameters, for this thesis, we have decided to make the necessary changes to the Poisson-Boltzmann/Monte Carlo method and apply it to the study of the effect on Cytochrome c oxidase. However, we have also applied our model to bacteriorhodopsin (bR) in order to confirm and validate the changes that we have introduced to the method. The work in this thesis is based on an implementation of this new method, consisting on its testing and preliminary application. It is the first time that these kind of computational methods have been applied to the study of membrane potential in Ccox. Before the inclusion of the membrane potential, the study of the titration behavior of titrable residues in Ccox showed that the titration of many of these residues was influenced by the pH gradient. However, our results show that some residues are highly influenced by the membrane potential, and some of them even become insensitive to the pH gradient. Given the results obtained for three key residues in the Ccox system, GLU-286i , TYC-288i , and LYS-362i we have concluded that it is unlikely that these residues are involved in a regulation mechanism, since they do not titrate at physiological values, when a membrane potential is present. Taking into account that the work presented in this thesis is essentially of implementation of a new method, the results presented here should be considered as a validation of the implementation and as an ensemble of preliminary results and conclusions that we intend to further explore, since it was not possible to do it in the time period established for the realization of this thesis. We intend to perform some future analyses to determine other biological implications of the presence of the membrane potential in Cytochrome c oxidase, being that the final objective of this work is the integration of this new method, presented here, in constant pH molecular dynamics simulations.