Comparative analysis of IgG1 and IgG2 subclasses against pA104R and pI215L of African Swine Fever virus in experimentally infected pigs and generation of pA104R based ASFV mutants towards the development of a live attenuated vaccine candidate

Abstract

ABSTRACT - African swine fever (ASF), caused by the African Swine Fever virus (ASFV) is a deadly, highly contagious disease affecting both domestic and wild pigs. Recognized as a notifiable disease by the World Organization for Animal Health (WOAH), ASF poses significant challenges to the pig husbandry due to its socio-economic impact globally. Current control measures, relying primarily on strict biosafety protocols, are inadequate for the eradication of the disease. Efforts to develop effective vaccines, including inactivated, subunit, DNA, and viral vectored types, have been unsuccessful, highlighting the potential of live attenuated vaccines (LAV) as the most promising approach. Hence, as new advancements in this matter require a better understanding of virus-host interaction and the underlying immune mechanisms, this study employed an in-house Enzyme-linked Immunosorbent assay (ELISA) to analyse the IgG1 and IgG2 patterns of the immune response against two key ASFV proteins in 63 serum samples from 23 experimentally infected pigs. These proteins were the histone-like pA104R, involved in DNA supercoiling, and the E2-ubiquitin conjugating enzyme pI215L, crucial for post translational protein signalling. Different aspects of the experimental infection and their impact on the recognition of the target proteins were investigated. Additionally, the study included an attempt to produce five new recombinant viruses, through the genetic modification of the A104R ORF, after studies of the rational mutagenesis of pA104R, using an immortalized cell line (3D4/31), and isolation of the recombinant viruses via cell sorting. The results obtained indicate a strong recognition of both viral proteins by swine antibodies of IgG1 subclass, suggesting a dominant Th2 response by the host. It was also demonstrated that acutely and subacutely infected animals presented a strong recognition of pI215L by IgG1 antibodies, while animals inoculated intramuscularly showed a stronger IgG2 response when compared to the oronasal route. Regarding the production of recombinant viruses, we observed minimal viral replication after several cycles of FACS, later confirmed by qPCR, likely due to limitations of the 3D4/31 cell line in supporting a full ASFV infection cycle. These findings underscore the importance of the viral proteins pA104R and pI215L as key immune targets in vaccine development, suggesting that using a rational mutagenetic approach, it could be possible to obtain a live attenuated vaccine

RESUMO – Análise comparativa das subclasses IgG1 e IgG2 contra pA104R e pI215L do vírus da Peste Suína Africana em suínos experimentalmente infetados e geração de mutantes ASFV baseados em pA104R para o desenvolvimento de uma potencial vacina viva atenuada - A peste suína africana (PSA), causada pelo vírus da Peste Suína Africana (ASFV), é uma doença mortal e altamente contagiosa que afeta porcos domésticos e selvagens, . Reconhecida como uma doença notificável pela Organização Mundial de Saúde Animal (WOAH), a PSA representa um desafio significativo para a suinicultura devido ao seu impacto socioeconómico global. As medidas de controle atuais, baseadas em protocolos rigorosos de biossegurança, provaram ser inadequadas na erradicação da doença. Os esforços para desenvolver vários tipos de vacinas eficazes têm sido infrutíferos, o que destacou o potencial das vacinas vivas atenuadas (VVA) como a abordagem mais promissora. Assim, como novos avanços nesta área exigem um melhor entendimento da interação vírus-hospedeiro e dos mecanismos imunológicos subjacentes, este estudo utilizou um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) para analisar os padrões de IgG1 e IgG2 da resposta imune contra duas proteínas chave do ASFV em 63 amostras de soro de 23 porcos infetados experimentalmente. Essas proteínas foram a histone-like pA104R, envolvida no enrolamento do DNA viral, e a E2- ubiquitin conjugating enzyme pI215L, crucial na sinalização após tradução de proteínas virais. Foram avaliados diferentes aspetos da infeção experimental e o seu impacto no reconhecimento das proteínas alvo. Além disso, o estudo incluiu a tentativa de produção de cinco novos vírus recombinantes, através da modificação genética da ORF A104R após estudos de mutagénese racional da pA104R, utilizando uma linha imortalizada de células (3D4/31), e o isolamento dos vírus recombinantes através da técnica de cell sorting. Os resultados obtidos indicam um forte reconhecimento de ambas as proteínas virais por anticorpos suínos da subclasse IgG1, sugerindo um predomínio da resposta Th2 por parte do hospedeiro. Também foi demonstrado que os animais infetados de forma aguda e subaguda apresentaram um forte reconhecimento da pI215L por anticorpos IgG1, enquanto os animais inoculados intramuscularmente mostraram uma resposta IgG2 mais forte em comparação com a via oronasal. Relativamente à produção dos recombinantes virais, observamos uma replicação viral mínima dos mesmos após vários ciclos de cell sorting, que foi confirmada por qPCR, provavelmente devido às limitações da linha celular 3D4/31 em suportar um ciclo completo de infeção por ASFV. Estes resultados sublinham a importância das proteínas virais pA104R e pI215L como importantes alvos imunológicos no desenvolvimento de vacinas, sugerindo ainda que, usando uma abordagem mutagénica aplicada e racional, poderá ser possível a obtenção de uma vacina viva atenuada.