The role of Rab6A-mediated protein trafficking in vascular development

Abstract

A rede vascular sanguínea é um sistema ramificado que irriga todos os órgãos em vertebrados, o que é fundamental para a embriogénese, a fisiologia e a regeneração. A disfunção desta rede está associada a múltiplas doenças, incluindo cancro, retinopatia diabética ou malformações arteriovenosas. A maioria dos vasos sanguíneos forma-se através da angiogénese, um processo realizado pelas células endoteliais (CEs), células que revestem o interior dos vasos sanguíneos. Durante este processo, as CEs estão constantemente expostas a estímulos, que ativam múltiplas vias de sinalização e regulam as suas várias funções, tais como a migração, a proliferação, e a especialização. Para tal, as CEs necessitam de um controlo rigoroso dos processos de tráfego intracelular, integrando desta forma os estímulos, através da endocitose/internalização e a secreção polarizada de proteínas sinalizadoras e recetores de membrana. A família de proteínas Rab GTPases é crucial para o tráfego intracelular pois regula a secreção, a endocitose e o tráfego de vesículas. Embora as Rab GTPases tenham sido recentemente reconhecidas como importantes reguladoras do tráfego das CEs, pouco se sabe sobre a forma como estes mecanismos regulam as funções das CEs e qual a sua relevância para o desenvolvimento dos vasos sanguíneos. A Rab6A é um dos principais membros das Rab GTPases, amplamente expressa na maioria das células de mamíferos e é conhecida por desempenhar um papel importante no transporte retrógrado e anterógrado de e para o complexo de Golgi. Para além de estar envolvida em vários passos do transporte vesicular, estudos realizados em células não endoteliais indicaram que a Rab6A participa em vários processos celulares, incluindo a adesão celular, a migração, e a regulação do ciclo celular, que são funções cruciais das CEs durante a angiogénese. Deste modo, a Rab6A parece ser uma forte candidata a mediar o tráfego intracelular das CEs. Por conseguinte, colocámos a hipótese de que a Rab6A é crucial para o desenvolvimento dos vasos sanguíneos, regulando várias funções. Para compreender o papel da Rab6A no desenvolvimento dos vasos sanguíneos, começámos por examinar a sua expressão nas CEs, utilizando dados de sequenciação de ácido rinonucleico (RNA) de CEs isoladas da retina de ratinho em diferentes fases do desenvolvimento pós-natal (sexto dia após o nascimento (P6), P10, P15, P21 e P50). Esta análise revelou que a Rab6A é expressa nas CEs da retina ao longo do desenvolvimento pós-natal. Assim, neste estudo, recorreu-se a uma abordagem in vivo usando ratinhos mutantes para a Rab6A em CEs, após a injeção de tamoxifeno. Para estudar o envolvimento da Rab6A durante a angiogénese, usámos a retina de ratinhos como modelo em diferentes etapas do desenvolvimento (P6, P12 e P30), uma vez que é um modelo bem estabelecido para o estudo do desenvolvimento vascular. A deleção da Rab6A em CEs de ratinhos neonatais afetou significativamente a vasculatura das retinas. De forma geral, observou-se que as retinas mutantes exibiram vasos com morfologia aberrante: dilatados (aumento do diâmetro dos vasos), com tortuosidade e imaturos (perda de quiescência). Estas alterações foram acompanhadas por extravasamento de glóbulos vermelhos dos vasos sanguíneos, levando a hemorragias. Adicionalmente, embora se tenha observado que o número de células “tip” e de filopodia estava aumentado nos mutantes, a migração das CEs estava alterada, o que levou a um atraso da expansão radial da vascularização da retina. Observou-se ainda que a formação das camadas intermédia e profunda das retinas mutantes estava comprometida. Verificou-se também que a Rab6A não é importante para manter a integridade dos vasos durante a idade adulta, uma vez que a sua deleção em ratinhos adultos não causou nenhum defeito na rede vascular. Deste modo, estes resultados sugerem que a Rab6A é maioritariamente importante durante o desenvolvimento dos vasos. Paralelamente, investigou-se se mais algum órgão estaria afetado pela deleção da Rab6A em CEs. Curiosamente, apenas foram observados defeitos na vasculatura dos cérebros de ratinhos mutantes. Estes apresentaram uma rede vascular desorganizada caracterizada por vasos com tortuosidade, algumas áreas avasculares e hemorragias. Observou-se, ainda, que nos cérebros mutantes o número das células “tip” estava aumentado, em comparação com o controlo. No entanto, algumas destas células “tip” exibiram uma morfologia aberrante, com estruturas semelhantes a microaneurismas. Além disso, muitas destas células apresentavam ausência quase completa de filopodia. Apesar destas diferenças morfológicas, não foram observadas alterações significativas tanto na densidade de vasos como na sua cobertura por pericitos. Com o objetivo de encontrar pistas para entender o mecanismo molecular que conduz às alterações observadas na vasculatura da retina e do cérebro de ratinhos mutantes para a Rab6A, recorremos à tecnologia de sequenciação de RNA de célula única (scRNA-seq), uma técnica que permite caracterizar os transcriptomas de células a nível individual. Embora o nosso objetivo inicial fosse o de realizar esta técnica em CEs de retinas mutantes para Rab6A, devido ao baixo número de CEs na retina, não o conseguimos fazer. Por isso, decidimos então realizar scRNA-seq em CEs dos cérebros mutantes e controlo em diferentes etapas do desenvolvimento vascular (P6, P12 e P30) e comparar os perfis transcriptómicos. Esta análise, revelou que, à semelhança do fenótipo observado nas retinas de mutantes, a etapa mais afetada pela deleção da Rab6A foi a P12, que apresentou um elevado número de genes diferencialmente expressos em comparação com o controlo. Nestes genes, observou-se que genes relacionados com o processo da angiogénese estavam sobre-expressos na ausência do Rab6A nas CEs do cérebro. Contudo, os genes que se encontraram mais sobre-expressos foram dois genes que foram identificados como estando envolvidos na proliferação celular, o Ccnb1ip1 (ou Hei10) e o Rpph1. Contrariamente, no P6 foi identificado um cluster de CEs maioritariamente composto por células mutantes para Rab6A que expressam genes que são regulados pelo fator de transcrição p53. Este fator é conhecido por ativar vários genes em resposta a vários tipos de stresses, tais como a ativação de oncogenes, hipoxia, danos no ácido desoxirribonucleico (DNA) e stress ribossómico. Embora esta análise nos tenha proporcionado informações sobre as alterações a nível transcriptómico após a deleção da Rab6A nas CEs do cérebro de ratinhos, não foi suficiente para entender o mecanismo na sua totalidade. É importante referir que a análise dos dados de scRNA-seq efetuada neste trabalho foi sumária, isto é não realizámos análises dos genes diferencialmente expressos nos diferentes clusters de CEs, mas apenas nas CEs mutantes para Rab6A versus CEs controlo. Assim, para obter uma análise mais precisa, estamos atualmente a analisar os genes diferencialmente expressos entre as CEs mutantes para Rab6A versus CEs controlo em cada cluster de CEs. Para complementar esta análise, seria de grande interesse realizar proteómica para identificar alterações a nível proteico após a deleção da Rab6A em CEs, uma vez que a Rab6A regula vários passos do tráfego de proteínas. O nosso estudo revela pela primeira vez o papel da proteína Rab GTPase Rab6A na angiogénese e na morfogénese vascular durante o desenvolvimento pós-natal. Os nossos resultados revelaram que a deleção pós-natal da Rab6A em CEs dá origem a defeitos vasculares significativos na retina e no cérebro, acompanhados por alterações na integridade da barreira entre o sangue e os tecidos. Para além disso, os nossos resultados sugerem que a Rab6A é essencial para o processo de angiogénese, regulando o brotamento de CEs (seleção de células “tip” e formação de filopodia), a migração, a proliferação, a formação e a maturação das barreiras hematoencefálica edos resultados e entender os mecanismos moleculares subjacentes às funções da Rab6A nas CEs. A compreensão destes mecanismos é crucial para o avanço do nosso conhecimento e pode oferecer informações sobre os processos angiogénicos e potenciais intervenções terapêuticas. hematorretiniana. No entanto, é ainda necessária mais investigação para confirmar alguns dos resultados e entender os mecanismos moleculares subjacentes às funções da Rab6A nas CEs. A compreensão destes mecanismos é crucial para o avanço do nosso conhecimento e pode oferecer informações sobre os processos angiogénicos e potenciais intervenções terapêuticas.

Angiogenesis is a complex biological process crucial for tissue growth, repair, and regeneration. Endothelial cells (ECs) orchestrate this process through coordinated migration, proliferation, polarization, and differentiation to form new blood vessels in response to microenvironmental cues. Intracellular trafficking plays a crucial role in regulating these processes. Despite considerable progress in understanding angiogenesis, key regulators mediating these trafficking events and controlling EC behaviors remain underexplored. Rab GTPases have recently emerged as crucial regulators of EC trafficking. Among them, Rab6A/A’ (referred to as Rab6A hereafter), the most abundant Golgi-associated Rab GTPase, is a major regulator of vesicular trafficking and is known to play several roles in cellular functions. This makes Rab6A a strong candidate for the regulation of EC trafficking, however, it has never been characterized in ECs. Thus, we hypothesize that Rab6A regulates several EC functions crucial for blood vessel development. The main objective of this thesis is to study the role of Rab6A in blood vessel development by characterizing the functional impact of postnatal Rab6A deletion in ECs in vivo. For that, we generated an inducible endothelial-specific knockout mouse model of Rab6A. Here, we show that Rab6A is required for angiogenesis and vascular barrier formation and maturation. Rab6A loss leads to aberrant vascular morphology with disrupted barrier integrity in the growing retina, characterized by hyper sprouting, with an increased number of tip ECs and filopodia at the vascular front, a hyper dense vascular network, with dilated and tortuous vessels, impaired vertical sprouting, and subsequent defective formation of the intermediate and deep vascular plexus. In the brain, Rab6A loss resulted in a disorganized vascular network with tortuous vessels, an increased number of tip cells, some exhibiting microaneurysm-like structures, and compromised barrier integrity leading to hemorrhages. These findings, for the first time, reveal that Rab6A, through its role in intracellular trafficking, influences various EC functions including migration, proliferation, angiogenic sprouting, and barrier formation and maturation. Understanding the mechanisms by which Rab6A regulates these EC behaviors could provide new therapeutic targets for treating aberrant angiogenesis in various diseases such as cancer and diabetic retinopathy.