How nuclear envelope grows old : exploring the biomechanical features of the nucleus during human aging

Abstract

O envelhecimento é um processo biológico complexo que afeta todas as células, tecidos e órgãos do corpo, levando a uma diminuição progressiva da capacidade funcional e aumentando a suscetibilidade a doenças. Este fenómeno resulta da acumulação gradual de danos moleculares e celulares ao longo do tempo, causados por uma variedade de fatores, como o stress oxidativo, a disfunção mitocondrial, diminuição dos telómeros, instabilidade genómica, perda da proteostase, entre outras. O envelhecimento também está associado à deterioração das funções dos mecanismos de reparo celular e à redução da capacidade regenerativa dos tecidos, particularmente devido à senescência celular — um estado em que as células perdem a capacidade de se dividir e de desempenhar as suas funções naturais. Assim, o envelhecimento para além de ser um processo biológico inevitável, é também um dos principais fatores de risco para o desenvolvimento de doenças crónicas, como as doenças cardiovasculares, neurodegenerativas, e diversas formas de cancro, exigindo uma compreensão mais profunda dos seus mecanismos subjacentes para o desenvolvimento de intervenções terapêuticas eficazes. Neste projeto, a nossa atenção centra-se no núcleo das células, estrutura particularmente interessante no contexto do envelhecimento, e numa caraterística específica, as alterações das propriedades mecânicas do núcleo. O Envelope Nuclear (EN) é uma estrutura essencial do núcleo, é responsável por isolar o conteúdo nuclear do citoplasma e manter a estabilidade do genoma. Além da sua função como barreira física, o EN regula interações nucleocitoplasmáticas, como o transporte de proteínas e ARN, a organização cromossómica e a resposta a sinais celulares. Alterações significativas na estrutura e função do EN surgem com o envelhecimento, associadas à perda de funcionalidade celular e ao desenvolvimento de doenças relacionadas com a idade, como a Progeria de Hutchinson-Gilford (HGPS) e outras laminopatias. Estas doenças são muitas vezes usadas como modelos para estudar o envelhecimento. Esta tese visa explorar as mudanças biomecânicas e biofísicas que ocorrem no EN ao longo do envelhecimento, com foco na rigidez nuclear, tensão e ordem da membrana nuclear, e dinâmica da Lâmina A. Para isso, foi desenvolvida uma abordagem multidisciplinar que integra técnicas avançadas de microscopia e criação de modelos de membrana in vitro. As técnicas empregadas incluem a Microscopia de Força Atómica (AFM) para avaliar a rigidez do EN, a Microscopia Confocal para observar a organização estrutural da Lâmina A e a ordem da membrana nuclear e a Microscopia de Tempo de Vida de Fluorescência (FLIM) para investigar a tensão da membrana. Um dos principais resultados foi o desenvolvimento de um protocolo sem detergentes para isolar núcleos de fibroblastos humanos primários, preservando a integridade do EN. Este protocolo permitiu estudar as propriedades biofísicas do EN em condições mais próximas ao ambiente fisiológico, fundamentais para compreender como as alterações biomecânicas poderão afetar a funcionalidade celular. Observou-se que o envelhecimento provoca um aumento significativo na rigidez do EN, o que pode estar relacionado com mudanças no processamento e distribuição da Lâmina A. A Lâmina A, componente essencial da lâmina nuclear, confere suporte estrutural ao EN e a sua desregulação durante o envelhecimento pode resultar num EN mais rígido e menos adaptável às exigências celulares. Outro achado relevante refere-se às medições de tempo de vida de fluorescência, que revelaram uma associação entre envelhecimento e aumento da tensão na membrana nuclear. Essa maior tensão, junto com a rigidez, pode comprometer a capacidade celular de responder a deformações mecânicas, influenciando o transporte de materiais entre o núcleo e o citoplasma, bem como a organização da cromatina. Adicionalmente, observou-se um aumento da ordem lipídica na membrana nuclear de células envelhecidas. Estas mudanças sugerem uma diminuição da flexibilidade necessária para manter a integridade nuclear, contribuindo para a senescência celular. Este estudo também identificou uma conexão entre alterações no EN e doenças relacionadas ao envelhecimento. Em células de pacientes com HGPS, foram identificadas mudanças que se assemelham às observadas no envelhecimento saudável, como desorganização da Lâmina A e aumento da rigidez nuclear. A correlação entre a rigidez do EN e a disfunção da Lâmina A sugere que o envelhecimento saudável e as laminopatias compartilham mecanismos biológicos semelhantes. Além de caracterizar estas alterações em células envelhecidas e em células de pacientes com HGPS, esta tese avança no desenvolvimento de modelos in vitro para estudar o EN em ambientes controlados. Um avanço significativo foi o uso de Vesículas Unilamelares Grandes (LUVs) para mimetizar o EN envelhecido. Ao isolar lipídios de núcleos de dadores idosos e usá-los para formar LUVs, foi possível criar um modelo simplificado para estudar as propriedades da membrana nuclear envelhecida. Este modelo poderá ser utilizado como uma plataforma inovadora para investigar como as mudanças lipídicas contribuem para as propriedades mecânicas do EN e o envelhecimento nuclear. As observações deste estudo destacam a importância da composição lipídica e da Lâmina A na manutenção da funcionalidade do EN. Intervenções que preservem a organização da Lâmina A e a homeostase lipídica podem potencialmente retardar os efeitos do envelhecimento no EN. Dado o papel central do EN na regulação de funções celulares essenciais, estas intervenções poderiam ter implicações significativas na promoção de um envelhecimento saudável e no desenvolvimento de terapias contra doenças relacionadas ao envelhecimento. Por fim, este trabalho sugere que estudos futuros devem focar em ampliar as investigações para células intactas, tanto de dadores jovens quanto idosos, bem como aumentar o número de pacientes com HGPS no estudo. Validar os resultados dos núcleos isolados em contexto celular permitirá avaliar se as alterações mecânicas e biofísicas observadas no EN se mantêm no ambiente celular completo. Este esforço contínuo ajudará a confirmar as conclusões desta tese e a direcionar o desenvolvimento de terapias para restaurar a função nuclear em células envelhecidas, potencialmente melhorando a qualidade de vida em estádios avançados da idade. A modulação da composição lipídica e da dinâmica da Lâmina A poderá abrir caminho para novas abordagens terapêuticas, capazes de preservar a integridade funcional do núcleo em células envelhecidas. Essas estratégias podem resultar em tratamentos inovadores que, ao estabilizarem a organização do envelope nuclear, reduzam o risco de doenças associadas à sua disfunção. Outro exemplo promissor é o uso de nanomedicina para introduzir lípidos específicos na membrana nuclear, visando restaurar a fluidez e elasticidade da mesma. A encapsulação de lípidos em nanopartículas direcionadas pode permitir uma distribuição precisa e controlada, com potenciais benefícios para a reversão de disfunções ligadas ao envelhecimento celular. Para além disso, paralelamente, o uso de ferramentas de edição genética, como a correção de mutações na Lâmina A e noutras proteínas do EN, representa uma área de investigação emergente com grande potencial terapêutico. Em conjunto, estas estratégias não só ambicionam tratar doenças associadas ao envelhecimento, mas também contribuir para uma melhoria significativa na qualidade de vida em idades avançadas, abrindo um novo horizonte na medicina regenerativa. Além disso, há uma necessidade crescente de aprofundar o estudo das interações entre os componentes do EN e outras estruturas, como o citoesqueleto, para entender melhor como o envelhecimento afeta a integridade global da célula. O EN não atua isoladamente e as suas funções estão intimamente ligadas a redes celulares complexas. Alterações nas suas propriedades mecânicas e biofísicas podem ter um efeito cascata, destabilizando outras estruturas celulares e contribuindo para o declínio funcional observado no envelhecimento. Estudos futuros que utilizem técnicas de imagem de alta resolução e modelos computacionais podem fornecer novas ideias sobre essas interações dinâmicas e identificar pontos de intervenção que possam preservar a homeostase celular como um todo.

The nuclear envelope (NE) is a fundamental cellular structure responsible for maintaining genomic stability and regulating various nuclear-cytoplasmic interactions, which are critical for proper cellular function. However, the ageing process leads to profound alterations in the NE, contributing to the decline in cellular function and the onset of age-related diseases. This thesis aims to elucidate the biomechanical and biophysical changes that occur in the NE during human ageing, focusing on the interplay between nuclear stiffness, membrane tension, lipid composition, and Lamin A dynamics. By integrating advanced techniques such as Atomic Force Microscopy (AFM), Confocal Microscopy, and Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM), this research provides a comprehensive analysis of how these properties evolve with age. A key achievement of this study is the development of a robust, detergent-free protocol for the isolation of nuclei from primary human fibroblasts, preserving the structural integrity of the NE. The results demonstrate that ageing is associated with increased nuclear stiffness, which may be driven by alterations in Lamin A processing and distribution, as well as changes in membrane tension and order. These biomechanical changes are hypothesized to impair NE flexibility and its ability to maintain nuclear key functions, contributing to cellular senescence and age-related pathologies. In addition to characterising these age-related changes, this thesis sets the initial foundations for the use of Large Unilamellar Vesicles (LUVs) as a model to mimic the aged nuclear environment. By isolating lipids from aged nuclei and using them to form LUVs, this work provides a novel platform for studying the specific contributions of lipid alterations to NE mechanics in a controlled setting. These findings not only advance our understanding of nuclear ageing but also highlight potential targets for preventive interventions aimed at preserving nuclear function and promoting healthy ageing.