Behavioral and cognitive defects in the VPA-ASD rodent model

Abstract

O distúrbio do espectro do autismo (ASD) é uma doença neurológica que afeta a comunicação, o comportamento social e o processamento sensorial. A causa exata da doença ainda é desconhecida, contudo, estudos sugerem que esta está relacionada com diversos fatores, incluindo genética, estrutura e função cerebral, fatores ambientais e neuroinflamação. Os indivíduos com ASD apresentam sintomas como dificuldades sociais, desafios de comunicação, comportamentos e interesses repetitivos, sensibilidades sensoriais, ansiedade e irritabilidade (Harris, 2018). Estudos de ressonância magnética (RM) mostraram que crianças com ASD apresentam maior volume cerebral em comparação com crianças sem a doença, contudo esse aumento tende a estabilizar. Além disso, estudos de RM funcional indicam que estes indivíduos têm uma atividade neuronal reduzida nas regiões do cérebro envolvidas na cognição social, e um aumento de atividade em regiões envolvidas no processamento sensorial (Brambilla et al., 2003; McAlonan et al., 2005; Thompson et al., 2005). Os mecanismos subjacentes às alterações cerebrais no ASD não são compreendidos na totalidade, contudo estudos revelam que fatores genéticos e ambientais contribuem para este distúrbio. Estudos sugerem que estes fatores podem estar na origem das alterações de cognição e processamento sensorial, contribuindo para os sintomas observados em indivíduos com ASD. Assim, o estudo dos circuitos neuronais é relevante para compreensão das alterações que contribuem para este transtorno. Existem vários circuitos neuronais que têm sido implicados no ASD, incluindo o circuito cerebral social e o circuito de recompensa (Südhof, 2008; J. H. G. Williams et al., 2001). Adicionalmente, o uso de modelos animais, como o de ácido valproico (VPA-ASD), tem sido uma das maiores ferramentas para o estudo e para o aprofundamento do conhecimento sobre o ASD humano (Mabunga et al., 2015; Rea & Van Raay, 2020). O ácido valproico (VPA) é um medicamento usado para tratar condições neurológicas e psiquiátricas, como epilepsia e transtorno bipolar. Este age em múltiplos alvos no cérebro, incluindo sistemas de neurotransmissores GABAérgicos e glutamatérgicos e respetivas vias de sinalização intracelular. Devido à sua capacidade de induzir comportamentos semelhantes aos observados em indivíduos com ASD, o VPA tem sido uma ferramenta crucial para criação de modelos animais e para a compreensão dos mecanismos subjacentes à doença (Zhuo et al., 2017). Este projeto de mestrado tem como objetivo investigar defeitos moto sensoriais e alterações cognitivas sociais no modelo animal VPA-ASD. Este projeto de investigação visa igualmente explorar o impacto dessas disfunções nas funções cognitivas. Com essa finalidade, foram executados vários testes comportamentais no modelo animal VPA-ASD, incluindo nocicepção, exploração livre, preferência social e testes de inibição por pré-pulso, para avaliar diferentes comportamentos associados ao modelo. Esses testes permitirão avaliar a sensibilidade do animal à dor, o seu comportamento exploratório, a atividade locomotora, o comportamento social e sensoriomotor. Espera-se que os resultados destes testes possam fornecer informações relevantes sobre a fisiologia das funções cognitivas superiores no modelo animal VPA-ASD. Para a execução deste trabalho, foram adquiridos quatro casais de ratos Long Evans do laboratório Charles River Laboratories France. Como resultados dos ciclos de reprodução entre estes casais, obtivemos uma amostra de 23 machos Long Evans, dos quais 12 foram utilizados como controlo (CTL), 9 como VPA400 (mães administradas com 400mg/kg) e 5 como VPA600 (mães administradas com 600mg/kg). A administração do VPA foi realizada ao dia 12.5 de gestação, período crítico do neuro desenvolvimento dos ratos. Os testes comportamentais foram iniciados assim que os ratos atingiram a idade adulta (dia 60 após nascimento). O teste de nocicepção mecânica teve como objetivo avaliar a sensibilidade dos ratos à dor. Este teste consistiu em aplicar pressão (através de um elétrodo) na pata posterior do rato e medir o tempo de reação e a força aplicada até à retirada da pata. Os resultados deste estudo demonstraram diferenças significativas na resposta mecânica entre os grupos (Kruskal-Wallis test, H = 104.190, n = 1626, ***p<0.001). O grupo CTL apresentou uma repostas mais rápida aquando da estimulação mecânica, indicando um limiar inferior em comparação com os outros dois grupos. Em contraste, o grupo VPA400 apresentou um limiar mais elevado, assim como o grupo VPA600, indicando respostas mais lentas e mais fracas a estímulos mecânicos. Estes resultados sugerem que a nocicepção mecânica encontra-se significativamente reduzida em ambos os grupos expostos ao VPA. O segundo teste nociceptivo, nocicepção térmica, foi executado com o objetivo de medir a sensibilidade dos ratos à dor através de estimulação térmica controlada. Foram realizados dois protocolos: em placa fria, onde a temperatura decrescia a um ritmo constante, e a placa quente, onde a temperatura crescia a um ritmo constante. Deste serão extraídas duas medidas essenciais: o tempo de reação e a temperatura correspondente. O estudo demonstrou que os ratos expostos ao VPA durante a fase pré-natal apresentaram uma sensibilidade reduzida às flutuações de temperatura e possuem tempos de reação mais lentos, em comparação com o grupo de controle (two-way ANOVA, F=14.2, n=67, ***p<0.001). Os resultados sugerem que a exposição ao VPA afeta os mecanismos subjacentes ao processamento moto-sensorial. Adicionalmente, os dados sugerem que o efeito da exposição ao VPA na reação de nocicepção térmica em ratos está relacionado com a dosagem, uma vez que o grupo VPA600 mostrou uma diferença significativa de resistência a estímulos mecânicos, em comparação com os VPA400 (Tukey post-hoc comparisons, **p<0.001). O teste de exploração livre (OFE) foi implementado para avaliar o comportamento exploratório dos animais. O objetivo deste estudo foi investigar como a exposição ao VPA afeta o comportamento motor e sensorial. Foram medidas a distância percorrida (que indicou o nível de exploração) e a velocidade dos ratos durante o teste (que indicou potenciais níveis de ansiedade). Verificou-se que existem diferenças significativas entre a exploração (ANOVA single-factor, F=8.015, n=23, **p=0.002) e os níveis de ansiedade (single factor ANOVA, F=8,0150, n=23, **p=0.003) entre os três grupos. Todos os grupos mostraram um comportamento cauteloso de exploração, passando a maior parte do tempo no segmento exterior. Conclui-se que a exposição pré-natal ao VPA afeta significativamente o comportamento motor e sensorial dos ratos, afetando a sua exploração do meio ambiente. O teste de Preferência Social (SP) foi executado de forma a medir o comportamento social dos ratos testados, avaliando a interação e a atração social. Quando testados com uma pista social do grupo CTL, os resultado indicam que houve diferenças significativas entre os três grupos relativamente ao tempo passado em interação (single-factor ANOVA, F=4.96, n=23, *p= 0.036). Verificou-se também que o grupo VPA600 apresentou os valores mais divergentes em comparação com os CTL (tukey post-hoc comparisons, *p<0.03) e com os VPA400 (Tukey post-hoc comparisons, *p<0.053). Contudo, quando testados com uma pista social VPA400, não foram encontradas diferenças significativas entre os grupos. Estes dados sugerem uma alteração na emissão de sinalização social por parte dos animais VPA. A inibição por pré-pulso (PPI) é um fenómeno sensorial importante no qual um estímulo fraco, quando apresentado antes de um estímulo forte, reduz a magnitude da resposta a este último. A PPI é uma medida crucial da capacidade do sistema nervoso para filtrar informações sensoriais irrelevantes, permitindo que sejam inibidos apenas os estímulos mais importantes. Os resultados deste estudo indicam que a exposição pré-natal ao VPA teve alterações significativas na resposta ao PPI, em comparação com o grupo de controlo (single-factor ANOVA, F=7.52, n=397, ***p<0.001). O efeito do VPA neste teste demonstrou-se ser dependente da dosagem, com o grupo VPA600 exibindo a maior alteração de resposta (Tukey post-hoc comparisons, **p=0.006). Além disso, a análise da força de reação mostrou que o grupo VPA600 teve a menor força de reação ao responder ao estímulo sensorial. Os resultados deste estudo sugerem que a exposição pré-natal ao VPA afeta o desenvolvimento sensoriomotor, um mecanismo importante para a filtragem de estímulos irrelevantes. Este projeto de mestrado investigou as deficiências sensoriomotoras e sociocognitivas no modelo de rato VPA-ASD e a sua correlação com as encontradas em humanos com autismo. O estudo identificou alterações significativas nos comportamentos pós-natal de ratos expostos ao VPA pré-natal, incluindo nocicepção mecânica e térmica comprometida, bem como o comportamento motor, exploratório, e social. Os resultados apoiam a utilização do modelo animal de VPA para a investigação do autismo e fornecem conhecimentos valiosos sobre o efeito da exposição a VPA, no processamento sensorial e no comportamento sociocognitivo em ratos. Desta forma, este estudo fornece conhecimentos valiosos que podem levar ao desenvolvimento de tratamentos inovadores que visem os mecanismos sensoriais.

Autism spectrum disorder (ASD) is a complex neurological disease characterized by restricted, repetitive behavior patterns and difficulties in social communication, whose pathophysiology is not fully understood (Tomchek & Dunn, 2007). Alterations in specific neuronal circuits in the brain, are believed to underly dysregulations in information processing and behavior, leading to difficulties with social communication and interpretation of social cues, and thus play a crucial role in ASD (Oberman & Ramachandran, 2007)(Oberman & Ramachandran, 2007), (Scott-Van Zeeland et al., 2010), (Pelphrey & Carter, 2008). Animal models have been developed to study the underlying molecular and neural circuitry mechanisms of ASD, including the Valproic acid (VPA) ASD model. VPA is an anticonvulsant drug used to treat neurological and psychiatric disorders, which can act on multiple targets within the brain, including neurotransmitter systems, ion channels, and signaling pathways, whose use during pregnancy leads to behavior alterations in the offspring, resembling those of ASD. This master thesis aims to investigate sensory motor defects and social cognitive impairments in the VPA-ASD rodent model. We aim to explore and understand the mechanisms underlying ASD by using several behavioral protocols to test cognitive functions, including nociception (sensitivity to pain), open field exploration (locomotor activity, anxiety, and exploratory behavior), social preference (social-cue baseddecision-makingg), and prepulse inhibition (sensorimotor gating). Behavior tests were performed on adult male rats exposed to VPA on day 12.5 of gestation (E12.5). The study focused of three groups: rats that were exposed to VPA at doses of either 400 mg/kg (VPA400) or 600 mg/kg (VPA600) and a control group that received saline injections (CTL). Our research shows that VPA exposure prenatally leads to significant changes in postnatal and adult behaviors, with compromised mechanical nociception, motor behavior, exploratory behavior, and higher anxiety levels. The study also reveals differences in active and passive social behavior in VPA-exposed rats. Our findings support the VPA animal model as relevant for autism research, and constitute valuable insights into the sensory-motor and social-cognitive impairments associated with ASD.