Investigating CD31 and Wnt driven signals in naïve CD4 T cell homeostasis

Abstract

O compartimento humano das células T CD4 naïve é indispensável para manter a imunocompetência do indivíduo durante a sua vida. Esta população de células é fundamental para proteger o sistema contra potenciais futuros antigénios patogénicos, em comparação às células T memória que são criadas para uma resposta mais eficaz a antigénios patogénicos já encontrados pelo sistema. As células T CD4 naïve são geradas no timo, durante o desenvolvimento das células T, e, uma vez maduras, emigram para a periferia, onde circulam entre o sangue e órgãos linfoides secundários. É aqui, nos órgãos linfoides secundários, que as células T naïve são expostas a estímulos homeostáticos que promovem a sua sobrevivência e proliferação. As principais vias de sinalização envolvidas na manutenção periférica deste compartimento são a estimulação tónica do TCR (recetor das células T), promovido pela interação de baixa afinidade com auto-péptidos/MHC (complexo de histocompatibilidade maior), e estimulação com a citocina IL-7. Com o avanço da idade, ocorre uma diminuição do número de células geradas pelo timo e, consequentemente, o sistema imune começa a depender cada vez mais desta manutenção das células T CD4 naïves estabelecida na periferia. No entanto, é importante notar, que a construção do TCR apenas ocorre no timo e, consequentemente, a proliferação periférica, não cria, apenas mantém a diversidade existente do reportório do TCR. Em contrapartida, o número de células T CD4 naïves também é regulado por outros processos, inclusive, morte celular e diferenciação para o compartimento efetor-memória, aquando do aparecimento de uma infeção. Assim, no contexto de homeostasia deste compartimento, torna-se relevante não só discutir vias de sinalização que promovem a sobrevivência e proliferação, mas também que são responsáveis por manter o fenótipo das células naïve. Dentro deste eixo de investigação, a via de sinalização Wnt/β-catenina/TCF1 tem ganho relevância, devido não só ao seu papel geral na diferenciação celular e manutenção de células estaminais, mas também por estar envolvido em vários processos relacionados com as células T. De facto, a sinalização do Wnt, mas especialmente, a expressão de TCF1, mostra ter um papel importante na manutenção do fenótipo das células T CD4 naïves e, uma vez ativadas, ocorre uma diminuição do seu nível de expressão. Para além disso, esta via de sinalização também tem sido estudada na geração de Tscms, células T estaminais de memória, uma subpopulação de células T de memória com propriedades semelhantes a células estaminais. Esta subpopulação de células recentemente identificada é descrita como tendo um fenótipo bastante semelhante às células naïve, com a exceção de também expressar CD95. O compartimento das células T CD4 naïve é, contudo, bastante heterogéneo e esta heterogeneidade não se reflete apenas em fenótipo, mas também em função e resposta a estímulos homeostáticos. Por exemplo, já dentro do compartimento naïve, existe a distinção entre células convencionais (Tconvs) e células regulatórias (Tregs), duas populações com funções distintas após ativação. Enquanto células naïves, ambas populações respondem de forma semelhante à estimulação com IL-7 in vitro, mas, quando analisadas ex vivo, as Tregs expressam níveis mais elevados de Bcl-2, pSTAT5 e Ki-67, o que indica que estão continuamente a responder a IL-7. O nosso projeto, contudo, foca-se na heterogeneidade criada pela expressão diferencial de CD31 (ou PECAM-1). De facto, o compartimento de células naïve pode ser divido em duas subpopulações de acordo com a expressão, ou não, de CD31 e que demonstram ter um historial proliferativo diferente. Vários estudos descrevem que as células T CD4 CD31+ passaram por menos ciclos de divisão, em comparação com células CD31neg. Além disso, as subpopulações definidas por CD31 demonstram responder de forma diferente a estímulos homeostáticos, inclusive na resposta à estimulação por IL-7 e TCR. Com este projeto procuramos investigar melhor o papel da expressão de CD31 na resposta das células T CD4 naïve aos estímulos homeostáticos do TCR e IL-7, mas também à sinalização do Wnt. Para tal, propusemo-nos, primeiro, a caracterizar as subpopulações naïves definidas pela expressão CD31, CD31+ e CD31neg, em amostras emparelhadas de sangue e amígdalas, um exemplo de órgão linfoide secundário. A quantificação da frequência de células que expressa CD31 em populações T CD4 de memória e naïves, mostrou, de forma esperada, que células naïves têm uma elevada percentagem de células CD31+, enquanto nas células de memória baixa drasticamente. No, entanto, nas Tscms encontrámos um padrão de expressão diferente das restantes células de memória, apresentado apenas uma perda parcial de células CD31+. Na análise da expressão de marcadores de células Tconvs CD4 naïves, observámos que, de forma geral, a subpopulação CD31+ têm uma expressão mais elevada de marcadores identificadores células T naïves. Por outro lado, as células CD31neg revelam ter uma maior frequência de células que expressam marcadores de ativação/homing, suportando a ideia de que esta subpopulação recebe mais estimulação pelo TCR. Análise não-supervisionada das amostras revelou a existência de subpopulações definidas por diferentes níveis de expressão de TCF1, sem relação com a expressão de CD31. Observamos, nomeadamente, a existência, presente em sangue e amígdalas, de uma população TCF1neg e, apenas presente em amígdalas, de células CD69+CD127lowTCFhigh. Adicionalmente, realizamos experiências in vitro de estimulação da sinalização do TCR e IL-7, em curta duração (3 horas), na presença de diferentes moduladores de CD31. A modulação foi feita em células CD4 Tconvs totais, sorteadas magneticamente, com o intuito de comparar parâmetros de resposta entre as subpopulações definidas por CD31. Infelizmente, esta experiência de forma geral revelou-se inconclusiva devido a vários fatores experimentais inesperados e, otimizações ao design experimental serão necessárias. Para além disso, procurámos investigar o impacto da sinalização de Wnt no compartimento de células T CD4 naïve e verificar se as subpopulações CD31+ e CD31neg respondem de forma diferente. Para tal finalidade, executámos culturas de células T CD4 naïves, com curta duração (3 horas), na presença de moduladores de via Wnt e estimulação da sinalização de TCR e IL-7. Encontramos alterações na expressão de marcadores da resposta a IL-7, CD127 e CD25, na presença do inibidor de GSK3, ativador da via Wnt. De forma semelhante, executámos culturas de longa duração (7 dias) na presença de moduladores da via Wnt e estimulação de IL Após os 7 dias de cultura, análise à resposta a IL-7 revelou que a ativação do Wnt impede a descida da expressão CD127 e o aumento da expressão de Bcl-2, o que sugere uma obstrução na sinalização da IL-7. Em alternativa, é também possível que a inibição de GSK3 interfira diretamente nos mecanismos de autorregulação da expressão de CD127 após sinalização. No entanto, este efeito é acompanhado por aumento na proliferação de células, especialmente células T CD4 naïves CD31+. A modulação da via Wnt também resultou em alterações fenotípicas, especialmente na presença de IL-7, nomeadamente na expressão de CD38 e CD95. De facto, nós observamos que, na presença de IL-7, ativação do Wnt diminui a expressão de CD38, enquanto, a inibição da via aumenta a expressão do marcador. Curiosamente, este efeito é mais evidente em células T CD4 naïves CD31neg. Dado que DKK-1 é um inibidor fisiológico da via Wnt, que aumenta sistemicamente com a idade, e o papel do CD38 na disfunção metabólica de células imunes, é possível que esta seja via reforçada com a idade que contribui para o envelhecimento de células CD4 T naïve. O aumento de expressão de CD95 foi observado tanto na presença individual de IL-7 e do ativador da via Wnt, todavia, na presença de ambos, este efeito mostra ser aditivo e intensificado, especialmente nas células naïves CD31+. Apesar desta observação ser interpretada por outros como levando à geração de Tscms, tais estudos foram efetuados na presença de estimulação pelo TCR e está ainda por demonstrar que o fenótipo adquirido seja estável e que as células assim geradas de facto representem Tscm. Análises adicionais à função efetora e fenótipo será necessário para confirmar a sua identidade.-7.

The naïve CD4 T cell compartment is essential to maintain the immunocompetence of the individual throughout their lifetime. This compartment, generated in the thymus, is sustained, in the periphery, by pro-survival signals and low proliferation, induced by the response to low-level TCR signalling and IL-7 stimulation. Other pathways, namely the Wnt/TCF1 axis, are suggested to be involved in the preservation of the naïve phenotype. However, the naïve CD4 T cells are a heterogeneous population and the impact of the existent heterogeneity on the response to homeostatic signals is yet to be completely understood. Within the naïve CD4 T cell compartment is well-established the presence of CD31-defined subsets, which have different homeostatic proliferative profiles. Here, we proposed to better understand the role of the CD31 expression in the response to signalling pathways involved in the homeostasis of the naïve CD4 T cell compartment, especially IL-7 and Wnt signalling. Additionally, since Wnt/TCF1 axis has been rarely studied in the context of naïve CD4 T cell homeostasis, we also aimed to investigate the impact of its modulation. Through our characterization of the CD31-defined subsets, we found the differences in the marker’s expression to be subtle, but potentially have implications in the response to stimuli. Moreover, we also identified a new level of naïve CD4 T cell heterogeneity defined by TCF1 expression, although unrelated to CD31. Following with in vitro experiments, we found a possible crosstalk between Wnt and IL-7 signalling pathways. Indeed, we found evidence that IL-7 stimulation has an addictive effect on the activation of Wnt signalling, while the Wnt activation hinders the response to IL-7. Moreover, the combined modulation of the Wnt pathway and IL-7 stimulation was shown to induce phenotypical changes, especially in the expression of CD38 and CD95, different between CD31 subsets.