Early neuronal development and adenosine signaling in the context of Mecp2-deficiency in Rett Syndrome

Abstract

A Síndrome de Rett (RTT) é um distúrbio raro, progressivo e monogênico do neurodesenvolvimento que afeta predominantemente o sexo feminino. Estima-se que a prevalência desta síndrome seja de 5 a 10 casos por 100.000 mulheres em todo o mundo, com a maioria dos casos sendo esporádicos. A apresentação clínica da RTT típica é caracterizada por quatro estágios distintos: estagnação, que ocorre entre 6 e 18 meses de idade; regressão rápida, normalmente entre 1 e 4 anos de idade; uma fase pseudoestacionária, começando por volta dos 2 anos de idade e potencialmente continuando ao longo da vida; e deterioração motora, a partir dos 10 anos de idade. Assim, dada a natureza crónica da RTT e a ausência de cura ou tratamento eficaz, a RTT exerce um impacto significativo na vida dos doentes, dos seus cuidadores e das suas famílias. Essa realidade destaca a urgência de avanços científicos para compreender os mecanismos subjacentes à RTT e desenvolver intervenções terapêuticas eficazes, que possam melhorar a qualidade de vida dos doentes. A RTT está primariamente associada a mutações no gene metil-CpG-binding protein 2 (MECP2), localizado no cromossomo X. A proteína MeCP2 desempenha funções cruciais como modulador epigenético e regulador da estrutura da cromatina, controlando a expressão de vários genes. Como modulador epigenético multifuncional, a MeCP2 contribui para diversas funções biológicas, especialmente durante o desenvolvimento e maturação do sistema nervoso central. Particularmente em contextos neuronais, a MeCP2 desempenha papéis críticos na diferenciação e maturação neuronal assim como na modulação da morfologia neuronal e em processos de plasticidade sináptica. Curiosamente, no sistema nervoso central (central nervous system – CNS) o MECP2 não é expresso apenas em células neuronais, mas também em tipos de células não neuronais, incluindo astrócitos, oligodendrócitos e microglia. Estudos anteriores revelaram que o fator neurotrófico derivado do cérebro (brain-derived neurotrophic factor - BDNF) é um dos alvos da atividade de fator de transacrição da MeCP2. O BDNF, uma neurotrofina crucial para diversos processos de neurodesenvolvimento, age principalmente através da ligação ao recetor de tropomiosina quinase B (tropomyosin-related kinase B - TrkB). Em pacientes com RTT, e em modelos animais com mutações no gene Mecp2, verifica-se uma redução na BDNF no tecido cerebral. Curiosamente, através de manipulação genética, o aumento dos níveis de Bdnf em modelos animais de RTT mostrou-se promissor para interromper ou amenizar os sintomas observados nos mesmo. No entanto, a administração clínica de BDNF é desafiadora devido à baixa permeabilidade da barreira hematoencefálica (blood-brain barrier - BBB) a essa neurotrofina. Assim, surgiram estratégias alternativas para potencializar as ações do BDNF. Estas incluem o uso de pequenas moléculas capazes de atravessar a BBB e ativar os recetores de BDNF, bem como direcionar tratamentos para outras vias de sinalização celular que levam à ativação da sinalização do BDNF. Neste contexto, as vias de sinalização da adenosina surgem como uma alternativa promissora para intensificar as ações do BDNF no cérebro. A adenosina atua como neuromodulador no CNS, exercendo as suas funções por meio da ativação de quatro recetores: A1R, A2AR, A2BR e A3R. Especificamente, a ativação dos recetores A2AR desencadeia uma sequência de eventos essenciais no neurodesenvolvimento, incluindo migração e polarização neuronal, crescimento de axónios e dendrites, e estabilização de sinapses GABAérgicas. Na verdade, o impacto da sinalização via A2AR não se limita aos efeitos mediados diretamente pela ativação do recetor. Sabe-se que a adenosina e agonistas adenosinérgicos para o recetor A2AR medeiam a facilitação de ações do BDNF. Assim, a interação entre a adenosina e o BDNF foi investigada no contexto da regulação da morfologia neuronal. Um estudo demonstrou que a ativação farmacológica dos A2AR está associada à promoção do alongamento do axónio e da ramificação das dendrites, características conhecidas por serem deficitárias no contexto de deficiências de Mecp2. Notavelmente, estudos anteriores do nosso grupo revelaram uma desregulação nos níveis de adenosina em modelos de ratinho de RTT. Essas descobertas realçam a complexa interação entre adenosina, BDNF e a patofisiologia da RTT, e sugerem que estratégias visando a modulação da sinalização adenosinérgica podem representar abordagens terapêuticas promissoras para atenuar o comprometimento neuronal associados à RTT. Nesse contexto, os objetivos delineados por esta tese foram: 1) Caracterizar processos do neurodesenvolvimento in vitro em neurónios com deleções no gene Mecp2 (Mecp2-null); 2) Avaliar as respostas morfológicas em neurônios Mecp2-null mediante a modulação farmacológica dos recetores A2AR; e 3) Identificar possíveis deficiências nas vias de sinalização do BDNF e da Adenosina em neurónios Mecp2-null. Através de técnicas de Imunofluorescência (IF), confirmámos a expressão da proteína Mecp2 em estágios iniciais do desenvolvimento in vitro, pelo menos desde dia 3 in vitro (days in vitro - DIV), atingindo seu pico durante estágios caracterizados por maior maturação neuronal (14 DIV). Uma vez atestada a expressão da Mecp2 a 3 DIV avaliamos o seu o papel no estabelecimento da morfologia neuronal em estágios iniciais do desenvolvimento. Assim, realizámos uma caracterização morfológica de neurónios Mecp2-null a 3 DIV, através da técnica de IF. Curiosamente, não identificamos alterações morfológicas em neurónios Mecp2-null, quando comparado neurónios controlo (i.e. que expressão níveis fisiológicos de Mecp2). Esta descoberta apoia a tese de que o Mecp2 não desempenha um papel essencial no estabelecimento da morfologia inicial de neurónios in vitro. Apesar da ausência de disparidades morfológicas evidentes sob condições fisiológicas, a manipulação farmacológica do recetor A2AR revelou respostas distintas e dependentes da concentração entre neurónios Mecp2-null e neurónios controlo, tanto em termos de alongamento das neurites quanto de ramificação. As disparidades observadas entre os genótipos sugerem um desequilíbrio nas vias de sinalização adenosinérgica nas células Mecp2-null. É notável que, tanto no processo de alongamento quanto no de ramificação das neurites, a concentração mais elevada do agonista seletivo dos recetores A2AR, CGS21680 a 100nM, provocou uma resposta exclusiva em neurónios Mecp2-null, sem desencadear uma resposta comparável nos neurónios WT. Em conjunto, a nossa análise morfológica em neurónios controlo e Mecp2-null a 3 DIV sugere que, mesmo antes da manifestação de alterações fenotípicas, há modificações moleculares discerníveis na via de sinalização A2AR num contexto genético sem a presença do gene Mecp2. Essas descobertas ressaltam o potencial para intervenções terapêuticas direcionadas à resposta singular das células Mecp2-null a elevadas concentrações do agonista A2AR. Utilizando a técnica de Western-Blot (WB), quantificamos os níveis de importantes componentes na sinalização do BDNF e da adenosina, nomeadamente ADK (adenosine kinase), TrkB e BDNF, em neurónios controlo e Mecp2-null em estágios avançados de maturação in vitro (14 DIV). Não foram observadas alterações significativas nos níveis dessas proteínas entre os dois grupos experimentais. No entanto, a ausência de alterações quantitativas observadas não exclui a possibilidade de modificações funcionais ou modulações específicas em outros componentes da via de sinalização. Dessa forma, uma análise mais abrangente dessas proteínas e das suas interações pode fornecer insights adicionais sobre os mecanismos subjacentes à sinalização de BDNF e adenosina. No geral, os resultados obtidos sugerem uma desregulação do sistema adenosinérgico na ausência de Mecp2, antecedendo manifestações morfológicas observáveis. Em conclusão, esta tese contribui para a compreensão do papel da Mecp2 nas fases iniciais do desenvolvimento neuronal, destacando a participação crucial do sistema adenosinérgico na regulação da morfologia das neurites em cenários de deficiência de Mecp2. Tais descobertas abrem perspetivas promissoras para o desenvolvimento de abordagens terapêuticas direcionadas ao sistema adenosinérgico para RTT, ressaltando a importância crítica da dosagem apropriada do tratamento e a relevância da intervenção precoce.

Rett syndrome (RTT), primarily caused by methyl-CpG-binding protein 2 (MECP2) gene mutations, is a rare and severe neurological disorder with limited treatment options. At the cellular level, RTT is characterized by disruptions in neuronal development and synaptic defects contributing to the RTT pathophysiology. Yet, data on earlier impairments in neuronal polarization in RTT is rather unclear. Adenosine, a crucial regulator of cell homeostasis, plays vital roles in neuronal migration, maturation, dendritic growth and synaptic stabilization through adenosine A2A receptor (A2AR) activation. Moreover, A2AR activation enhances signaling of Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF), whose levels and pathways are altered in RTT. Considering that RTT is associated with alterations in neuronal development – process influenced by A2AR and BDNF signaling - targeting adenosine signaling emerges as a potential therapeutic approach to prevent or reverse neurodevelopmental impairments in RTT. This study aims to characterize early morphological impairments in Mecp2-null mouse primary cultured neurons and assess their morphological responses upon A2AR modulation. First, we observed that Mecp2 is expressed as early as 3 days in vitro, despite the absence of observable differences in early neurite morphology between wild-type (WT) and Mecp2-null neurons at this stage. Intriguingly, our exploration of A2AR pharmacological modulation revealed distinct and concentration-dependent responses between Mecp2-null and WT neurons. Specifically, treatment with an A2AR agonist facilitated neurite elongation in Mecp2-null cells, while no effects were observed in WT neurons concerning neurite elongation and branching. These findings not only indicate dysregulation of the adenosinergic system in the absence of Mecp2 but also suggest potential therapeutic approaches for RTT and emphasize the crucial role of early intervention. In conclusion, this study provides insights into Mecp2's role in early neuronal development, underscoring the crucial relevance of the adenosinergic system in regulating neurite morphology in the context of Mecp2 deficiency.