The impact of the IL-17-microbiota crosstalk in peripheral nerve repair

Abstract

As lesões nos nervos periféricos são uma complicação comum na clínica, geralmente resultando de eventos traumáticos e com uma incidência superior a 11 em cada 100.000 pessoas. O sistema nervoso periférico (SNP) possui um mecanismo intrínseco de reparação que permite a reconstituição de nervos lesionados. Contudo, este mecanismo no ser humano é defeituoso, resultando em morbilidades a longo prazo, tais como disfunção motora e dor crónica. O processo de regeneração envolve longas e numerosas intervenções terapêuticas, que podem levar a incapacidade prolongada, dificuldades motoras e compensações vitalícias, tornando estas lesões uma grande preocupação não só clínica como socioeconómica. O processo de regeneração do SNP começa com a desintegração dos axónios lesionados num processo chamado degeneração walleriana, com concomitante desmielinização e desdiferenciação das células de Schwann (CS) para um fenótipo proliferativo. Durante este processo, as CS, juntamente com macrófagos residentes no nervo, secretam fatores pró-inflamatórios que por sua vez recrutam e ativam neutrófilos e monócitos, apoiando a remoção de mielina e detritos celulares. Essas células imunológicas secretam também fatores inflamatórios, fortalecendo assim o ambiente pró-inflamatório. À medida que o local da lesão é limpo, macrófagos pró-inflamatórios (tipo M1) polarizam-se para um fenótipo pró-reparador (tipo M2), estimulando a secreção de fatores neurotróficos que promovem o crescimento axonal. Simultaneamente, as CS guiam e remielinizam os novos axónios em crescimento, que re-inervam o tecido alvo. Apesar dos macrófagos e neutrófilos estarem bem caracterizados neste processo, os linfócitos T, em particular os produtores de IL-17A (doravante IL-17), têm permanecido em grande parte inexplorados. A IL-17 é uma citocina produzida principalmente por células T auxiliares 17 (Th17) e células T γδγδ. Esta citocina pró-inflamatória tem sido associada à defesa contra infeções e a doenças inflamatórias crónicas, como esclerose múltipla, síndrome de Guillain-Barré e doença de Alzheimer. Mais recentemente, estudos têm mostrado que a IL-17 pode também regular a função dos tecidos em homeostasia e promover a regeneração. Curiosamente, a microbiota do hospedeiro é necessária para a manutenção e função das células produtoras de IL-17. A microbiota, de facto, é capaz de regular ambos os papéis da IL-17 tanto em patologia como em homeostasia, promovendo doenças pró-inflamatórias e comportamentos semelhantes ao autismo, enquanto que estimula também a regeneração de tecido muscular e ósseo. Por outro lado, a IL-17 é capaz de selecionar as populações comensais do hospedeiro no trato intestinal, pele e mucosa pulmonar, moldando efetivamente a composição microbiana do hospedeiro. Com este contexto em mente, formulámos a hipótese de que a interação entre a IL-17 e a microbiota pode promover a reparação do nervo periférico após lesão. Observações preliminares mostraram que as células T produtoras de IL-17 acumulam-se no nervo ciático após uma lesão por esmagamento, atingindo o seu pico 3 dias após a lesão. Para testar se esta acumulação é impulsionada pela microbiota do hospedeiro, tratámos murganhos C57BL/6 com um cocktail de quatro antibióticos de amplo espectro, com o intuito de eliminar a microbiota antes de induzir uma lesão por esmagamento do nervo ciático. Linfócitos do nervo e do nódulo linfático poplíteo, que o irriga, foram isolados, estimulados e corados para análise por citometria de fluxo 3 dias após a lesão. Observámos uma diminuição significativa, especificamente nas células T produtoras de IL-17 e nas células T regulatórias, sem efeito nas células T do tipo 1, tanto no nervo quanto no nódulo linfático drenante. Estes resultados foram congruentes com os obtidos no nódulo linfático contralateral, sugerindo que a microbiota regula a acumulação de células T produtoras de IL-17 de forma sistémica. Além disso, e considerando que a IL-17 molda a microbiota, utilizámos murganhos geneticamente deficientes em IL-17 (Il17-/-) e competentes para IL-17 (Il17+/+) da mesma ninhada e estabelecemos dois sistemas de alojamento: um no qual os murganhos foram separados por genótipo, tendo assim microbiomas diferentes; e outro no qual os animais foram alojados em conjunto, compartilhando a mesma composição microbiana. Através da utilização do índice de função ciática (SFI) como indicador da função ciática, descobrimos que os animais Il17-/- separados não recuperam completamente a função motora (SFI=60%), contrariamente aos controlos Il17+/+ (SFI>80%). No entanto, quando alojados em conjunto, tanto os animais Il17+/+ quanto os Il17+/+ recuperam a função ciática em 20 dias. Estas observações sugerem que a IL-17 promove a recuperação da função motora da ciática por meio da microbiota. Para entender os mecanismos moleculares envolvidos, obtivemos seções transversais do nervo ciático ao longo do processo de regeneração em ambas as condições de alojamento, a fim de testar a expressão relativa dos marcadores clássicos de regeneração: neurofilamento (NF) e proteína associada ao crescimento 43 (GAP43). Para isso, usámos imunocoloração e microscopia de fluorescência para analisar a expressão de proteínas específicas. Observámos que não há diferenças significativas na expressão de NF em murganhos Il17+/+ e Il17-/- em ambas as condições de alojamento, mostrando uma cinética de expressão esperada. De realçar, NF, como uma proteína do citoesqueleto axonal, não distingue axónios intactos de axónios em regeneração, podendo mostrar a mesma expressão em ambos os casos, mesmo que as fibras se encontrem em diferentes processos biológicos. Ainda assim, esses dados sugerem que a IL-17 não afeta o crescimento axonal. Ao investigar a expressão de GAP43, presente tanto nos axónios como nas CS não mielinizantes, murganhos Il17-/- separados mostram um aumento de expressão ao dia 7 pós-lesão, quando comparados aos controlos. No entanto, quando os animais foram alojados em conjunto, ambas as linhagens apresentaram uma expressão similar. Estes dados suportam a hipótese de um papel indireto, através da microbiota, na expressão de GAP43. Para testar esta hipótese, tratámos animais de ambos os genótipos, alojados de forma separada, com um cocktail de antibióticos, e constatámos que os níveis de expressão de GAP43 não diferem entre os grupos. Curiosamente, os resultados em animais Il17-/- separados, sugere que, na primeira semana após lesão, a sobre-expressão de GAP43, resulta numa regeneração desregulada, o que pode traduzir numa recuperação motora disfuncional. Como a expressão de GAP43 pode não ser o único mecanismo pelo qual o crosstalk IL-17-microbiota regula a recuperação motora, trabalhos futuros, por exemplo ao nível da junção neuromuscular e plasticidade sináptica, são necessários para compreender melhor este processo complexo. Por fim, estudos recentes sugerem que as CS expressam o recetor de ligação da IL-17 e que a IL-17 pode afetar a mielinização das fibras após a lesão. Ao extrair nervos de animais alojados em conjunto, 28 dias após a lesão, realizámos cortes transversais e corámos o nervo ciático para analisar a morfometria geral do nervo e o estado de mielinização. Ao comparar os animais Il17+/+ e Il17-/-, observámos que a IL-17 não afeta o número de fibras e sua densidade dentro do nervo, restabelecendo totalmente a densidade e números dos nervos contralaterais. Da mesma forma, em relação aos parâmetros de tamanho das fibras, observámos uma diminuição expectável no calibre do axónio no nervo ipsilateral comparativamente ao contralateral em ambas as linhagens, embora não haja diferenças significativas entre elas. Além disso, a razão g (g-ratio), uma medida da espessura relativa da bainha de mielina, não difere entre murganhos Il17+/+ e Il17-/-. Globalmente, esses dados sugerem que a IL-17 não influencia a mielinização ou a morfometria do nervo após a lesão, em condições de coabitação. Contudo, não descartamos a hipótese de um efeito indireto por meio da microbiota e, portanto, no futuro, avaliaremos a bainha de mielina em animais separados. Em suma, nesta dissertação mostramos que o crosstalk bidirecional IL-17-microbiota promove a regeneração do SNP após lesão. Por um lado, observámos que a acumulação de células T produtoras de IL-17 no nervo após a lesão é suprimida com tratamento com antibióticos, sugerindo que é dependente da microbiota. Ao mesmo tempo, mostramos que, por meio da microbiota, a IL-17 promove a recuperação motora e regulação da expressão de GAP43. Estas observações abrem novos caminhos a ser explorados, com intuito de aliviar o impacto clínico e socioeconómico destas lesões.

Peripheral nervous system (PNS) injury is a major clinical and economical concern that leads to chronic pain and motor dysfunction. The immune system plays a critical role after PNS damage, clearing the site of injury and secreting growth factor for axonal regeneration. Although the role of macrophages and neutrophils is well known, the function of T cells in this process remains underexplored. Recent studies have highlighted a crosstalk between IL 17A (henceforth IL 17) producing T cells and the gut, with IL 17 shaping the microbiota, and the microbiota modulating IL 17 response in tissue. Prior evidence from the laboratory shows an accumulation of IL 17 producing cells in the sciatic nerve after surgical axonotmesis injury. In this thesis, we hypothesised that IL 17 accumulation is driven by the microbiota. Accordingly, we observed a significant reduction of IL 17 T cells and regulatory T cells in mice treated with broad spectrum antibiotics. To analyse the role of IL 17 in motor function after injury, we used IL 17 genetically deficient Il17 --//--) mice and their IL 17 competent ( Il17 +/++/+) littermates, in co housed or separated housing conditions. We found that, when separated, I l 17 mice did not fully recover motor behaviour, stagnating at 60% of the sciatic function. Though, when co housed, Il17 animals recover in just 20 days, akin to the controls. Mechanistic ally, we demonstrated that separated Il17 mice have a dysregulated expression of the regeneration marker growth associated protein 43 (GAP43), which was restored when co housed with Il17 mice or when treated with antibiotics. Overall, our data suggests a bidirectional pathway of the IL 17 microbiota crosstalk in regulating PNS regeneration. On one hand, the microbiota promotes IL 17 accumulation after injury, while on the other, IL 17 regulates functional repair through GAP43 expression in a microbiot a dependent manner.