In-vitro investigation of interindividual variability on Plasmodium falciparum Infection : red blood cells underlying mechanisms

Abstract

Contexto: A malária continua a ser um desafio significativo para a saúde pública. O relatório mais recente destaca 249 milhões de casos e 608,000 mortes em 2022, o que marca uma inversão na tendência de queda observada de 2000 a 2015. A doença manifesta-se num espectro que vai desde a infeção assintomática, que contribui para a transmissão, até à malária não complicada, comum em adultos semi-imunes, e malária grave, que afeta principalmente crianças e mulheres grávidas. A carga patogénica de um hospedeiro impacta significativamente na gravidade das doenças infeciosas, em que cargas mais elevadas resultam em doenças graves e morte. Esta associação é estabelecida em várias doenças, tais como a infeção por vírus da imunodeficiência humana, COVID-19 e sépsis, incluindo a malária. Por exemplo, marcadores elevados como o Plasmodium falciparum histidine rich protein 2 (PfHRP2) sinalizam um risco aumentado de doença grave. Além disso, a efetividade do artesunato no tratamento da malária grave resulta da rápida taxa de redução do parasita, visto que atua em múltiplas fases do ciclo de vida do mesmo. Destacando o princípio de que, uma maior carga parasitária correlaciona-se com doença mais grave e morte. Fatores do hospedeiro, particularmente aqueles associados aos glóbulos vermelhos (GVs), influenciam o crescimento do Plasmodium e, consequentemente, o espectro da malária: (i) A membrana, crucial para funções fisiológicas, é relevante para a sobrevivência e interação com o parasita da malária. Alterações na membrana dos GVs têm sido demonstradas a mitigar a gravidade da doença. (ii) Os GVs abrigam um conjunto único de enzimas para o seu metabolismo energético. Alterações nessas enzimas podem afetar o crescimento do parasita no hospedeiro. (iii) Variações na hemoglobina, sendo o traço falciforme um exemplo primário, oferecem efeitos protetores contra a malária. Estes elementos sublinham a complexidade das interações hospedeiroparasita na malária e destacam a importância das características dos GVs na determinação da gravidade da doença. Estudos controlados de infeção humana por malária e experiências in-vitro demonstraram uma notável variabilidade interindividual nas taxas de crescimento do Plasmodium falciparum (Pf), destacando diferenças nas parasitémias entre indivíduos nunca expostos à malária e indivíduos imunes. Culturas in-vitro mostraram taxas de crescimento altamente variáveis, atribuídas a diferenças nos GVs do dador. Esta variabilidade também foi observada num estudo cujo objetivo era investigar os efeitos da ingestão de açúcar por voluntários no crescimento do parasita, no nosso laboratório. Tal variabilidade interindividual levantou questões sobre os fatores do hospedeiro que podem causar estas diferenças, sugerindo que uma caracterização mais detalhada poderia fornecer informações importantes e potencialmente úteis para intervenções contra a malária. Objetivos: Este estudo tem como objetivo determinar a variabilidade das taxas de crescimento do Pf in-vitro, utilizando GVs de voluntários sem exposição prévia à malária, categorizando-os em padrões de crescimento baixo ou alto, com base em fatores dos GVs do hospedeiro. Bem como com a colheita de dados dos voluntários para encontrar ligações potenciais com esses padrões e análise de parâmetros clínico-laboratoriais para identificar associações. Métodos: O estudo recrutou voluntários adultos sem exposição prévia à malária, predominantemente da Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa (FMUL) e do Instituto de Medicina Molecular (iMM), todos tendo dado consentimento informado antes da participação. O estudo foi dividido em três fases distintas: 1. Avaliação inicial e realização das culturas: Foi solicitado aos participantes que preenchessem um questionário abrangente cobrindo dados demográficos, hábitos alimentares, exposição prévia à malária, estado de saúde atual e histórico médico, com um foco em qualquer histórico de anemia. Cada voluntário contribuiu com aproximadamente 14 mL de sangue, usado para testes de glicemia capilar, determinação dos níveis de hemoglobina e grupos sanguíneos AB0/Rh, e início de culturas com a estirpe laboratorial Pf 3D7. As culturas de Pf foram estabelecidas seguindo protocolos padrão para culturas de parasitas invitro, utilizando meio de cultura completo, com distintas suplementações. Durante um período de 96 horas, estas culturas foram monitorizadas e a parasitémia foi avaliada por microscopia ótica. O objetivo foi categorizar os voluntários em coortes de crescimento distintas—crescimento baixo (LG), crescimento normal (NG) e crescimento alto (HG)—com base nas parasitémias de cada voluntário. 2. Reprodução dos resultados e testes adicionais: Para confirmar os achados iniciais, um subconjunto de vinte e quatro voluntários forneceu amostras de sangue adicionais. Os voluntários foram convidados a fornecer sangue para um conjunto de testes hematológicos e bioquímicos de rotina, realizados num laboratório de referência credenciado, com o objetivo de determinar correlações com os padrões de crescimento do parasita observados. 3. Exploração do fenótipo de invasão: Na fase conclusiva do estudo, oito voluntários forneceram novas amostras de sangue para experiências adicionais. Os GVs desses voluntários foram marcados com o corante Cell-Trace-Far-Red (CTFR) para investigar os fenótipos de invasão do Pf, com um foco específico na observação da variabilidade na marcação do CTFR entre os GVs dos voluntários. O tratamento e análise de dados envolveu vários métodos estatísticos, incluindo os testes: exato de Fisher; t de Student; ANOVA unilateral e U de Mann-Whitney para comparar variáveis categóricas e numéricas, com resultados apresentados em frequências, médias, intervalos, desvios padrão e medianas conforme apropriado. Este estudo recebeu aprovação ética do Centro Académico de Medicina de Lisboa (Número de Aprovação Ética 496/18). Resultados: Este estudo analisou culturas de Pf de 69 voluntários. O crescimento do parasita foi categorizado em grupos de crescimento LG, NG e HG, com diferenças significativas entre os grupos (d de Cohen = 5.4; P<0.0001). O grupo LG teve uma média de razão de crescimento 4.7, NG de 9.7 e HG de 16.0. A reprodutibilidade foi alta num subgrupo de 24 voluntários (R² = 0.99). Na análise de fatores demográficos como idade, género e nacionalidade, não surgiram diferenças significativas entre os grupos de baixo e alto crescimento (LG e HG). No entanto, uma tendência notável foi a maior prevalência de indivíduos com ascendência de regiões endémicas de malária no grupo LG, sugerindo possíveis fatores genéticos que influenciam a resistência à malária, merecendo estudo adicional. Quanto à saúde e medicação, ambos grupos tinham membros com condições médicas, particularmente alergias ou asma, e usavam medicamentos como contracetivos e anti-histamínicos, não sendo encontrada correlação significativa com as taxas de crescimento do parasita. Os hábitos alimentares foram consistentes entre os voluntários, tendo todos consumido uma refeição rica em carbohidratos antes da colheita. Membros do grupo LG foram mais propensos a ter comido menos de uma hora antes da colheita. Não foram observadas diferenças impactantes nos níveis de glicose ou marcadores metabólicos e inflamatórios básicos entre os grupos. Ao longo do estudo, nenhum participante relatou casos atuais de anemia, e o menor crescimento do parasita no grupo LG não foi devido a sintomas de anemia, como detalhado na Tabela 14. Cinco voluntários do grupo LG tinham históricos de anemia, identificados através de diagnóstico médico, durante doações de sangue ou exames de rotina, mas nenhum tinha o diagnóstico de anemia durante as participações no estudo. O grupo LG também relatou um histórico familiar superior de anemia do que os outros. Interessantemente, o grupo sanguíneo AB0 não mostrou implicações significativas nas taxas de crescimento do parasita. No grupo HG, as variáveis hematológicas estavam dentro dos intervalos normais. Testes iniciais revelaram níveis de hemoglobina abaixo do limite inferior de referência para três voluntários LG na 1ª fase (n=69) e para quatro voluntários LG na fase 2 (n=24). O grupo LG também mostrou menor média de hemoglobina em comparação com HG, tanto na fase um (12.3 vs 14.8 g/dL, P=0.03) quanto na fase dois (12.7 vs 13.9 g/dL, P=0.04). Os níveis de reticulócitos e ferro tendiam a ser mais baixos no grupo LG, embora não significativamente, com reticulócitos (%) em 0.9 vs 1.2, P=0.07, e ferro (μg/dL) em 75.5 vs 103.1, P=0.07. Não foram detetadas variantes anormais de hemoglobina nos voluntários da fase 2. Uma análise preliminar (n=4 LG e n=4 HG) do CTFR mostrou uma tendência para maior média na intensidade de fluorescência mediana no grupo HG em comparação com o grupo LG. Conclusão: Este estudo realça a significativa variabilidade nas taxas de crescimento do Pf entre os GVs dos voluntários, revelando um contraste acentuado entre GVs que suportam taxas de crescimento baixas versus altas em condições in-vitro, excluindo influências imunológicas e fatores séricos. Tal variabilidade não pôde ser explicada por variáveis demográficas ou pelo grupo sanguíneo, desafiando algumas observações de estudos anteriores. As principais diferenças entre os grupos de crescimento baixo (LG) e alto (HG) estavam ligadas a históricos pessoais e familiares de anemia, refletidos em níveis distintos de hemoglobina, contagens de reticulócitos e níveis de ferro, apesar da sobreposição substancial de valores. A ausência de hemoglobinopatias comuns adiciona complexidade à identificação da causa desta variabilidade. Achados preliminares indicam possíveis alterações na membrana dos GVs, sugeridos pela análise do marcador CTFR, potencialmente associados a níveis reduzidos de hemoglobina e históricos de anemia. Pesquisas futuras devem focar na expansão dos coortes LG e HG para explorar de forma mais abrangente fatores relacionados à membrana, enzimas ou hemoglobina, utilizando possivelmente estudos genómicos e proteómicos. Esta abordagem visa desvendar os mecanismos intrínsecos subjacentes à variabilidade dos GVs em suportar o crescimento do Pf.

Background: Malaria, impacting 249 million globally in 2022, ranges from asymptomatic to severe cases, significantly affecting young children and pregnant women. Disease severity correlates with pathogen load, underscoring the importance of red blood cells (RBCs) factors like membrane properties, enzymatic activities and haemoglobin variations in influencing Plasmodium growth and malaria outcomes. Significant interindividual variability in Plasmodium falciparum (Pf) growth rates in-vitro and in-vivo underscores the complex dynamics of host-parasite interactions. Methods: Malaria-naive volunteers from the Faculty of Medicine, University of Lisbon, were recruited for a three-phase study that included questionnaire assessments, blood sampling for parasite culture to establish growth patterns, and a series of haematological and biochemical analyses to identify associations with RBC traits among low (LG) and high growth (HG) groups. Results: The study of 69 volunteers identified distinct growth patterns (low: LG, normal: NG, high: HG) with significant variability not accounted for by demographic or blood group factors. A trend towards ancestry from malariaendemic regions in the LG group hinted at genetic factors. No significant effects of dietary habits, health status, or medication on growth rates were found. Notably, variations in haemoglobin levels and histories of borderline anaemia were observed between LG and HG despite no detected haemoglobinopathies. Preliminary results suggest potential RBC membrane alterations through Cell- Trace-Far-Red marker analysis. Conclusion: The study highlights the variability in Pf growth rates caused by RBC factors, independent of immunological influences, demographics, or blood group, with borderline anaemia (history and blood results) playing a role. Future research should increase the LG and HG cohorts and expand on these findings through detailed exploration of RBC characteristics, possibly using advanced genomic and proteomic techniques, aiming to elucidate the mechanisms affecting malaria susceptibility and outcomes.