Cytokine gene expression and cellular immune response in dogs with leishmaniosis before and under the two first-line treatment protocols : new insights into the animal disease

Abstract

Canine leishmaniosis (CanL) caused by Leishmania infantum is a zoonotic visceral disease of worldwide concern. The drugs used for its treatment improve the animal’s clinical condition, although, in most cases, the parasites are not completely destroyed. The current study aimed to evaluate the immune response of the dog with leishmaniosis before and during treatment with first-line drugs, by analyzing the profile of cytokines and subsets of CD4+ and CD8+ T-cells in peripheral blood, lymph node and bone marrow. Two groups of six dogs diagnosed with CanL were treated with either miltefosine or meglumine antimoniate in combination with allopurinol. Simultaneously, another group of ten clinically healthy dogs was used as a control group. Upon diagnosis and during the following three months of treatment, clinical signs, hematological and biochemical parameters, urinalysis results and anti-Leishmania antibody titers using IFAT were recorded. Furthermore, peripheral blood, popliteal lymph node and bone marrow mononuclear cells were collected to evaluate the gene expression of IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, TNF-α, TGF-β and IFN-γ by qPCR. In parallel, these cells were also immunophenotypically analyzed be flow cytometry, using surface monoclonal antibodies anti-CD45, CD3, CD4, CD8, CD25 and intracellular monoclonal antibody anti-nuclear factor FoxP3. Both treatment protocols promoted the remission of clinical signs, normalization of hematological and biochemical parameters and urinalysis values. Sick dogs showed a generalized increase in IFN-γ gene expression and a decrease of IL-2, IL-4, and TGF-β. The expression of IL-12, TNF-α, IL-5, and IL-10 showed variations between groups of dogs and the tissue analyzed. CanL also resulted in an overall increase in the percentage of CD8+ T-cells in all tissues. In the peripheral blood there was also a decrease in CD4+ T-cells and an increase of CD4+CD25+FoxP3+ and CD8+CD25+FoxP3+ T-cells, with the latter also increasing on the bone marrow. CD4+CD25-FoxP3- T-cells showed a marked decrease in blood and bone marrow. During treatment, a trend towards normalization of cytokine gene expression and T-cell subsets was observed. However, high levels of IFN-γ gene expression were still observed in all tissues. In turn, the treatments caused an increase in the percentage of CD4+CD25+FoxP3+ and a decrease in CD8+CD25-FoxP3- T-cells, leading to normalization of CD4+ and CD8+ T cells in all tissues. Furthermore, the effect of treatment on gene expression of cytokines that were not significantly altered by infection indicates that these combined treatment protocols directly affect cytokine production. Both combined treatments are effective in remitting clinical sings and appear to influence the dog’s immune response, sustaining a pro-inflammatory immune environment while promoting the normalization of T-cell subsets. These findings indicate that L. infantum may be able to manipulate elements of the dog's immune system to avoid differentiating an efficient protective response, preventing the rapid development of severe pathology while ensuring the parasite’s survival and securing the possibility of several transmission cycles. Allied to these results, other studies carried out in collaboration with the working group on the role of neutrophils, hepatocytes and Kupffer cells in CanL, as well as the evaluation of treatment in feline leishmaniosis, have allowed to enhance the knowledge in the area of animal leishmaniosis.

RESUMO - Expressão génica de citocinas e resposta imune celular em cães com leishmaniose antes e sob os dois protocolos de tratamento de primeira linha: novas informações sobre a doença animal - A leishmaniose canina (LCan) causada por Leishmania infantum é uma doença visceral zoonótica de interesse mundial. Os fármacos utilizados para o tratamento melhoram o estado clínico do animal, embora, muitas das vezes, os parasitas não sejam totalmente eliminados. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a resposta imunitária do cão com leishmaniose antes e durante o tratamento com fármacos de primeira linha, através da análise do perfil de citocinas e subconjuntos de células T CD4+ e CD8+ no sangue periférico, linfonodo e medula óssea. Dois grupos de seis cães diagnosticados com LCan foram tratados com antimoniato de meglumina ou miltefosina em associação com alopurinol. Em simultâneo, outro grupo de dez cães clinicamente saudáveis foi usado como grupo controlo. Aquando do diagnóstico e durante os três meses consecutivos de tratamento, foram registados os sinais clínicos, parâmetros hematológicos e bioquímicos, resultados de urianálise e títulos de anticorpos anti-Leishmania obtidos por IFAT. Células mononucleares do sangue periférico, linfonodo e medula óssea foram recolhidas para avaliação da expressão génica de IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, TNF-α, TGF-β e IFN-γ por qPCR. Em paralelo, estas células foram também analisadas imunofenotipicamente por citometria de fluxo, com anticorpos monoclonais de superfície anti-CD45, CD3, CD4, CD8, CD25 e anticorpo mononuclear intracelular anti-factor nuclear FoxP3. Ambos os protocolos de tratamento promoveram a remissão dos sinais clínicos, a normalização dos parâmetros hematológicos, bioquímicos e dos valores de urianálise. Cães doentes mostraram um aumento generalizado da expressão génica de IFN-γ e diminuição de IL-2, IL-4 e TGF-β. A expressão de IL-12, TNF-α, IL-5 e IL-10 apresentou variações entre os grupos de cães e o tecido analisado. A LCan levou também a um aumento generalizado da percentagem de células T CD8+ em todos os tecidos. No sangue verificou-se ainda diminuição de células T CD4+ e aumento de células T CD4+CD25+FoxP3+ e CD8+CD25+FoxP3+, com estas últimas aumentando também na medula. As células CD4+CD25-FoxP3- mostraram diminuição acentuada no sangue e medula óssea. Durante o tratamento, foi observada uma tendência para a normalização da expressão génica de citocinas e subconjuntos celulares. No entanto, níveis elevados da expressão génica de IFN-γ foram observados em todos os tecidos. Por sua vez, os tratamentos causaram um aumento da percentagem de células T CD4+CD25+FoxP3+ e diminuição de células T CD8+CD25-FoxP3-, levando à normalização os valores de células T CD4+ e CD8+ em todos os tecidos. Adicionalmente, o efeito do tratamento na expressão génica de citocinas, que não se encontravam alteradas aquando da infeção, é indicador de que estas terapêuticas combinadas afetam diretamente a produção de citocinas. Ambas as terapêuticas combinadas são eficazes na remissão dos sinais clínicos e parecem influenciar a resposta imunitária do cão, sustentando um ambiente imunológico pró-inflamatório e promovendo a normalização de subconjuntos de linfócitos T. Estes resultados indicam que L. infantum poderá ser capaz de manipular elementos do sistema imunológico do cão para impedir a diferenciação de uma resposta protetora eficaz, evitando o rápido desenvolvimento de patologia grave, enquanto assegura a sobrevivência do parasita, garantindo a possibilidade de vários ciclos de transmissão. Aliado a estes resultados, estudos realizados em colaboração pelo grupo de trabalho sobre o papel dos neutrófilos, hepatócitos e células de Kupffer na LCan, assim como a avaliação do tratamento na leishmaniose felina, permitiram agregar mais conhecimentos na área da leishmaniose animal.