Precision medicine for canine lymphoma : identification of novel and potent cytotoxic compounds for conjugation into an antibody-drug conjugate

Abstract

ABSTRACT - Oncologic diseases have a significant impact on both animal and human health. Canine lymphoma is the most common hematologic malignancy and shares several similarities with human non-Hodgkin lymphoma. Various therapeutic strategies exist for treating canine lymphoma, but chemotherapy remains the primary treatment in most cases. However, this modality often fails to achieve optimal treatment outcomes. Patients undergoing chemotherapy may experience side effects due to the systemic toxicity of the drugs used, and many develop drug resistance, leading to refractory or relapsed cases. Therefore, it is crucial to invest in innovative therapeutic strategies for canine lymphoma. In human medicine, the incorporation of immunotherapies into treatment protocols for non-Hodgkin lymphoma has shown promising results. Monoclonal antibodies conjugated with cytotoxic payloads (ADCs–Antibody-drug conjugates) are an example of an immunotherapy modality that has shown promising results. Previous studies conducted by the Microbiology and Immunology Laboratory (FMV ULisboa) have demonstrated the efficacy of an ADC, which utilised the SN-38 payload, against canine lymphoma cells. Building on this, the present study aimed to identify other compounds with different mechanisms of action and high potency as promising candidates for the development of innovative ADCs for canine lymphoma treatment. A panel of eight molecules was selected and tested in two canine lymphoma cell lines (CLBL-1 and 17-71). Microtubule inhibitors (MMAF, MMAE, and DM1) and targeted protein degraders (MS4078, DT2216, NX-2127, ARV-825, and ARV-771) were chosen. The cytotoxicity assays revealed a range of IC50 values (half-maximal inhibitory concentration), with the three most potent compounds (MMAE, DM1, and ARV-825) showing IC50 values between 380 pM and 67.41 nM. In addition to assessing their individual potency, the synergistic effects of combining SN-38, MMAE, and ARV-825 were evaluated. Mathematical models applied to combination assays demonstrated that the combination of SN-38 with ARV-825 exhibited significant synergism. The results obtained enabled the selection of extremely potent cytotoxic molecules with different mechanisms of action, which could be conjugated into innovative ADCs, contributing to the development of a novel class of therapeutic molecules against canine lymphoma

RESUMO – MEDICINA DE PRECISÃO NO LINFOMA CANINO: IDENTIFICAÇÃO DE CITOTÓXICOS NOVOS E POTENTES PARA CONJUGAÇÃO NUM CONJUGADO ANTICORPO-FÁRMACO - As doenças oncológicas têm um grande impacto na saúde humana e animal. O linfoma canino é a neoplasia hematológica mais frequente no cão e tem diversas semelhanças com o linfoma não Hodgkin humano. Existem vários protocolos terapêuticos que podem ser implementados em pacientes com linfoma canino, sendo a quimioterapia o tratamento de eleição na maior parte dos casos. No entanto, a eficácia terapêutica nem sempre é a desejada. Para além disso, os protocolos de quimioterapia estão muitas vezes associados a eventos adversos devido à toxicidade sistémica dos fármacos utilizados e ao desenvolvimento de resistências que fomentam o aparecimento de casos refratários e recidivas. Deste modo, surge a necessidade de desenvolver novas estratégias terapêuticas. Em medicina humana, a implementação de imunoterapias nos protocolos terapêuticos de linfoma não Hodgkin trouxe resultados promissores. Uma das modalidades da imunoterapia que tem apresentado resultados promissores são os anticorpos monoclonais conjugados com moléculas citotóxicas (ADCs - “Antibody-drug conjugates”). Em projetos anteriores, realizados pelo Laboratório de Microbiologia e Imunologia (FMV-ULisboa), foi comprovada a eficácia de um ADC conjugado ao citotóxico SN-38 na inibição do crescimento de células de linfoma canino. Deste modo, o presente estudo pretendeu identificar outros compostos com mecanismos de ação diferentes e de elevada potência que possam ser candidatos promissores para o desenvolvimento de ADCs inovadores no tratamento do linfoma canino. Para isso, foi selecionado e testado um painel de oito compostos promissores em duas linhas celulares de linfoma canino (CLBL-1 e 17-71). Foram selecionadas moléculas inibidoras de microtúbulos (MMAF, MMAE e DM1) e degradadores seletivos de proteínas (MS4078, DT2216, NX-2127, ARV-825 e ARV-771). De entre os oito compostos testados em ensaios de citotoxicidade celular, obtiveram-se valores de IC50 (concentração inibitória média) distintos, sendo MMAE, DM1 e ARV-825 os compostos mais potentes, com IC50 entre os 380 pM e os 67.41 nM. Para além da sua ação individual foi avaliado o efeito sinérgico da associação dos compostos SN-38, MMAE e ARV-825 entre si. Foi detetado um efeito sinérgico significativo entre os compostos SN-38 e ARV-825. Os resultados obtidos permitiram selecionar citotóxicos extremamente potentes, com diferentes mecanismos de ação, que podem ser utilizados na conjugação de novos ADCs, contribuindo para o desenvolvimento de uma nova classe de moléculas terapêuticas para o tratamento do linfoma canino