Tackling the complexities of microplastic extraction and Nile Red analysis in human faeces to assess impacts on gut microbiota

Abstract

Desde a invenção do primeiro plástico, a produção global de plásticos aumentou exponencialmente, ultrapassando 390 milhões de toneladas em 2021 e com projeções de atingir mais de 700 milhões de toneladas até 2040. Como muitas vezes o plástico é fabricado para uso único e descartado, tem contribuído para o aumento da poluição ambiental. Esta poluição por plásticos tem emergido como uma das maiores preocupações ambientais do século XXI, não apenas pela sua abundância, mas também pelas suas potenciais implicações na saúde humana. Dentro deste contexto, os microplásticos (MPs), plásticos com dimensões inferiores a 5 mm de diâmetro, tornaram-se um foco crescente de preocupação, dado o seu pequeno tamanho que os torna capazes de dispersar pelo ambiente, entrar em cadeias alimentares e aumenta o seu potencial de bioacumulação em organismos. Estes MPs são omnipresentes no ambiente, na alimentação e até em tecidos humanos. A crescente investigação de MPs indica a sua presença em vários tecidos e fluidos humanos e levanta questões relevantes sobre os seus possíveis efeitos nocivos. A presença de MPs já foi associada a diversos efeitos biológicos adversos como inflamação, stresse oxidativo, danos ao DNA, distúrbios reprodutivos e neurotoxicidade, e nomeadamente na microbiota intestinal (GM), um sistema complexo e essencial para a saúde. A exposição humana ocorre principalmente por ingestão, inalação e contato dérmico, sendo a ingestão a mais estudada. MPs entram no corpo através de alimentos e água contaminados, muitas vezes devido à degradação de embalagens ou à bioacumulação em produtos de origem animal. Estima-se que indivíduos possam ingerir até 15 gramas de MPs por mês, dependendo da região e hábitos alimentares. Uma preocupação acerca desta exposição alimentar é a interação entre MPs e a microbiota intestinal (GM). Em modelos animais, observa-se que a exposição a MPs pode causar disbiose, redução da diversidade microbiana e mudanças na composição bacteriana. Porém, em humanos, as evidências ainda são escassas e variáveis, refletindo diferenças nos tipos de MPs, formatos, concentrações e metodologias experimentais. Para realizar a avaliação de exposição humana a MPs, tem havido um crescente aumento no uso de amostras fecais humanas devido ao método de recolha não invasivo e por permitirem estudar interações MPs-GM diretas. No entanto existe uma grande variedade de metodologias de extração de MPs para avaliar a sua presença. Estas englobam técnicas de digestão comuns, que incluem digestão química com bases (KOH, NaOH), oxidantes (H₂O₂), ácidos (HNO3), enzimas (celulase, lípase) ou combinações dos vários reagentes, assim como a aplicação dos reagentes em variados volumes, concentrações e temperaturas. Adicionalmente, existe também variação no uso de técnicas complementares para reduzir a quantidade de matéria orgânica, tais como a separação por densidade e lavagens pós-filtração. Após a sua extração os MPs são geralmente caracterizados por técnicas de espectroscopia como FTIR e Raman, capazes de caracterização química e morfológica. No entanto, estas técnicas são dispendiosas, demoradas e requerem instrumentação altamente especializada. Uma técnica capaz de circunvalar estas limitações e que pode ser usada isolada ou como uma pré-preparação a estas técnicas é a coloração com o corante lipofílico vermelho de nilo (NR). Apesar de menos precisa, representa uma alternativa de baixo custo e tem sido aprimorada com o uso de “machine learning”. No entanto, apenas dois estudos utilizaram essa técnica em amostras fecais e nenhum em humanos, reforçando a necessidade de desenvolver e harmonizar protocolos analíticos com o uso de NR. Assim, o principal objetivo deste projeto foi desenvolver um protocolo de extração e deteção de MPs robusto, adaptável e reprodutível em amostras fecais, de modo a poder posteriormente inferir potenciais associações entre MPs e GM. Para tal, o trabalho iniciou-se com uma revisão crítica da literatura, para sistematizar as diferentes técnicas e condições usadas para a remoção de matéria orgânica e de onde várias metodologias foram replicadas para atestar as melhores condições para esta remoção. A primeira fase envolveu a comparação de diferentes métodos de preparação da amostra, a pré-digestão, como liofilizar as amostras, separar as fezes, misturar com água ou etanol e secar. A liofilização revelou-se o método de pré-digestão mais eficaz, superando a simples secagem por calor ou a mistura com água ou etanol. Este passo também permitiu uniformizar o peso das amostras, minimizando a variabilidade induzida pela humidade. Posteriormente, foram testadas várias combinações de agentes, nomeadamente peróxido de hidrogénio (30% H₂O₂) e hidróxido de potássio (10% KOH), variando volumes, temperaturas e tempos de digestão. O H₂O₂ demonstrou maior eficácia na remoção de matéria orgânica, enquanto o KOH foi essencial para desagregar a matriz fecal. A combinação sequencial de ambos, com incubação de 24 horas a 50 ºC para cada reagente, mostrou-se ideal, equilibrando eficiência de digestão com preservação dos MPs. Esta abordagem foi complementada com um sistema de agitação, que melhorou a consistência da digestão ao evitar a aderência de resíduos às paredes dos frascos. No tratamento pós-digestão, o uso de água a ferver e etanol (≥99.5%) revelou-se eficaz na remoção de resíduos e interferências fluorescentes, sem comprometer a recuperação dos MPs. Métodos como a centrifugação ou lavagem com acetona, apesar de melhorarem a remoção de matéria orgânica, comprometeram a recuperação de MPs, especialmente para polímeros como o poliestireno (PS). Uma vez estabelecido o protocolo de extração, procedeu-se à otimização da coloração com NR. Diversos tempos de exposição (5, 15 e 30 minutos) foram testados em diferentes tipos de plástico (LDPE, PP, PS, uPVC), quer em amostras limpas ou contaminadas. Observou-se que 5 minutos de coloração eram suficientes para obter fluorescência adequada sem aumentar significativamente a coloração de matéria orgânica residual. Além disso, foram definidos tempos de exposição e intensidades LED para três filtros fluorescentes (UV-25ms, azul-25ms, verde-50ms), com base na intensidade de píxel (PI) dos MPs. Para a deteção automatizada, desenvolveu-se um modelo de deteção de MPs (MP-DM), utilizando software de análise de imagem (QuPath), onde se aplicaram limiares de fluorescência e características morfológicas baseadas em partículas de plástico e matéria orgânica. Esta abordagem foi validada com partículas conhecidas, alimentos parcialmente digeridos e amostras fecais reais, com um desempenho robusto na deteção de MPs ≥50 μm. Após a validação, o protocolo completo foi aplicado a quatro amostras fecais humanas. A seleção baseou-se na diversidade microbiana (α-diversidade) e na razão Bacillota/Bacteroidota, parâmetros que têm sido associados à exposição a MPs. No total, foram detetadas cinco partículas suspeitas de serem MPs: nenhuma partícula foi observada na amostra com maior diversidade (F4), uma na com menor diversidade (F27), e duas em cada uma das restantes (F24 e F32). Embora a deteção confirme a aplicabilidade do método a amostras reais, a baixa quantidade de MPs e o reduzido número de amostras limitaram inferências robustas sobre uma possível relação entre a presença de MPs e a composição da microbiota intestinal. Este trabalho evidencia várias contribuições importantes. Em primeiro lugar, demonstrou que a coloração com NR pode ser adaptada com sucesso para a análise de fezes humanas, desde que suportada por um protocolo de preparação rigoroso. Em segundo lugar, apresentou uma abordagem semiautomatizada para deteção de MPs, com potencial para ser expandida com técnicas de “machine learning”. Por fim, reforça a necessidade de padronização metodológica neste campo, de modo a permitir comparações entre estudos e avaliações fiáveis de exposição humana a MPs. Contudo, várias limitações devem ser reconhecidas. A amostra reduzida de participantes impede generalizações, e a deteção baseada apenas em NR, apesar da sua acessibilidade, carece de confirmação química por técnicas como FTIR ou Raman. Além disso, a natureza altamente variável das fezes humanas torna difícil a obtenção de um protocolo universal. Diferentes dietas, hábitos intestinais e composição alimentar influenciam drasticamente a matriz fecal, e consequentemente a eficácia da digestão. Para trabalho futuro será necessário a confirmação dos potenciais MPs detetados como realmente MPs com técnicas de espectrofotometria mais exatas como FTIR ou Raman. A aplicação do protocolo desenvolvido a um número maior de amostras, incluindo populações com diferentes condições clínicas ou estilos de vida poderá permitir uma melhor observação das relações de MPs com a GM. O uso de ferramentas computacionais, como inteligência artificial, poderá também melhorar a precisão da deteção e classificação dos diferentes tipos de polímeros. Adicionalmente, o uso de enzimas específicas (ex: celulase) poderá ajudar a mitigar os falsos positivos associados à fluorescência de matéria orgânica rica em celulose. Em suma, este trabalho apresenta um contributo significativo para o avanço da investigação em MPs em amostras biológicas humanas. Oferece um protocolo acessível, eficiente e passível de replicação, enquanto reforça a complexidade técnica e biológica inerente a este tipo de análise. Embora preliminar, a metodologia aqui desenvolvida abre caminho para estudos mais alargados e sistemáticos, fundamentais para compreender melhor os impactos dos MPs na saúde humana.

Microplastics (MPs) are ubiquitous environmental contaminants increasingly linked to potential health risks, particularly through dietary exposure and their possible impact on the gut microbiota (GM). However, to properly evaluate the potential effects of MPs there is a need for an adequate evaluation of MP exposure. Many methods have used human faecal samples to detect MPs, however, they are limited to expensive and time-consuming methodologies. Nile Red (NR) staining has been used to detect MPs, yet no study has yet used it in real-world human faecal samples. And so, this study aimed to develop an efficient protocol for the extraction and detection of MPs in human faecal matter using Nile Red (NR) staining, a more accessible alternative, yet less accurate. Various sample preparation steps were evaluated, including pre-digestion, digestion, and post-digestion methods, to maximise organic matter removal while preserving MP integrity. These evaluations allowed the establishment of a comprehensive extraction protocol, starting with the lyophilisation of faecal samples, followed by a sequential digestion process involving 30% hydrogen peroxide (H₂O₂) and 10% potassium hydroxide (KOH) at 50ºC for 24h each, followed by boiling water and ethanol washes. A complementary MP detection model (MD-DM) was also developed using characteristics based on various types of MPs and organic matter. The use of this extraction and detection protocol confidently detected possible MPs ≥50 μm in human faecal samples. The application of the protocol to real-world samples revealed the presence of MPs in three out of four samples. However, no significant association was found between MP presence and GM composition. Overall, these findings suggest that the developed protocol demonstrates strong potential for a preliminary screening tool for extracting and detecting MPs, even though limited by the small sample size and MP detection. Nevertheless, further validation using advanced spectroscopic and chemical characterisation techniques is essential to confidently confirm MP particles and to explore the complex relationship between MPs and human GM.