Into the regulation of glucose homeostasis: from periphery to brain

Abstract

The main goal of this thesis was to have an integrative view both in peripheral glucose homeostasis and its impact on brain synaptic proteins content. In our first study we hypothesized that N-acetyl-cysteine (NAC) as a source of the essential amino acid cysteine, critical for glutathione (GSH) synthesis, impacts on peripheral insulin sensitivity. Glucose excursions and insulin sensitivity were assessed together with levels of nitric oxide (NO) in normal and hepatic parasympathetic (HPN) denervated animals. In this study we observed that NAC in the presence of glucose leads to an increase in insulin sensitivity in peripheral tissues in non denervated animals. These results suggest that NAC acting as a source of cysteine for glutathione synthesis is an essential feeding signal increasing insulin sensitivity. Our second hypothesis states that a high sucrose diet (HSD) impacts on peripheral glucose tolerance resulting in changes in GLUT4 and GLUT12 proteins content and fat accumulation. Moreover, HSD also results in changes in synaptic proteins content in hippocampus and cortex of this animal model. Glucose tolerance, fat and lean mass accumulation were evaluated at 4, 24 and 36 weeks of diet. At these time points animals were sacrificed and hippocampus and cortex removed in order to evaluate synaptic proteins content, namely synapsin-1, rabphilin-3 and synaptophysin as well as those involved in the SNARE complex formation, SNAP-25 and syntaxin. Consumption of a HSD lead to development of glucose intolerance with decreased GLUT4 content and increased GLUT12 in skeletal muscle in a compensatory manner. Fat accumulation was observed in animals submitted to HSD at 24 and 36 weeks of diet simultaneously with alterations in synaptic proteins content implying compromised synaptic function. Within synaptic proteins The integrity of glucose homeostasis is a key factor that influences not only peripheral insulin sensitivity but also brain synaptic transmission as features of diabetes.

A diabetes mellitus é uma doença metabólica bastante comum, sendo considerada atualmente como epidemia. Estima-se que em 2030, cerca de 552 milhões de pessoas tenham desenvolvido diabetes e que cerca de 183 milhões venham a desenvolvam esta doença, não estando diagnosticada, sendo por isso uma doença que constitui grande importância para a saúde pública. A diabetes mellitus pode ser dividida em dois subtipos: diabetes tipo 1 ou tipo 2. A diabetes tipo 1, também denominada por diabetes dependente de insulina, é caracterizada pela falência das células β do pâncreas que deixam de produzir insulina, sendo este tipo mais comum em crianças ou jovens adultos. A diabetes tipo 2 está associada ao estilo de vida que conduz ao desenvolvimento de resistência à insulina, normalmente caracterizada por elevados níveis de glicose (hiperglicemia) e insulina (hiperinsulinémia) no sangue. Antes de a doença ser diagnosticada, os doentes apresentam normalmente um estado de pré-diabetes, que é caracterizado por valores de glicemia elevados no estado pós-prandial. Atualmente existem diversos modelos animais para o estudo de doenças metabólicas, nomeadamente para a diabetes tipo 1 e tipo 2. Nestes modelos a diabetes pode ser induzida química ou nutricionalmente, sendo neste último caso utilizadas dietas enriquecidas em açúcar ou gordura. A presente tese teve como principal objetivo obter uma visão integrativa da homeostase da glicose a nível periférico assim como o seu impacto ao nível da transmissão sináptica no cérebro, nomeadamente no conteúdo das proteínas sinápticas. A primeira parte deste trabalho focou-se em avaliar o efeito do aminoácido cisteína (através da administração de N-acetil-cisteína, NAC) na sensibilidade periférica à insulina. Tem sido descrito que os aminoácidos têm um papel importante na sensibilidade à insulina periférica no estado pós-prandial. Além disso, sabe-se que a cisteína é um aminoácido essencial para a síntese de glutationo, que desempenha um papel fundamental na libertação de uma substância denominada HISS (Hepatic Insulin Sensitizing Substance), que por sua vez promove um aumento na sensibilidade à insulina nos tecidos periféricos. Assim, na primeira parte desta dissertação, colocou-se a hipótese de que a administração intra-entérica de NAC tem influência na sensibilidade à insulina nos tecidos periféricos. Para a realização deste trabalho foram utilizados ratos Wistar fêmeas com 9 semanas, que foram divididos em 4 diferentes grupos. Ao primeiro grupo foi administrada intra-entericamente glicose (grupo controlo), ao segundo apenas NAC, ao terceiro NAC e glicose e ao quarto grupo foi administrado NAC e glicose após ser realizada a desnervação hepática dos animais. A desnervação teve como objetivo inibir a ação dos nervos parassimpáticos hepáticos. Para testar a hipótese proposta, foi avaliada a tolerância à glicose através de um teste de tolerância à glucose intra-entérico, em que os resultados são obtidos na forma de área sob a curva dos valores de glicose medidos durante os 120 minutos do teste; a sensibilidade à insulina foi também avaliada, através do RIST (Rapid Insulin Sensitivity Test), que é um teste euglicémico em que os níveis de glicose são mantidos perto dos valores basais durante todo o teste. Os níveis de óxido nítrico no plasma e fígado foram determinados através de um método baseado na quantificação de nitratos e nitritos. Observou-se que a administração intra-entérica de NAC na presença de glicose aumenta a sensibilidade à insulina nos tecidos periféricos. Além disso, a desnervação dos animais previne o aumento da sensibilidade à insulina promovida pelas administrações de NAC e glicose, sendo esta sensibilidade semelhante aos animais controlo. Os níveis de óxido nítrico não foram alterados em nenhum dos grupos experimentais referidos, nem no plasma nem no fígado, exceto no grupo de animais desnervados, onde se verificou uma diminuição dos níveis de óxido nítrico tanto no plasma como no fígado. Os resultados obtidos sugerem que a coadministração de NAC com glicose induz o aumento da sensibilidade à insulina nos tecidos periféricos, atuando como um sinal essencial para o aumento da sensibilidade à insulina. Podemos concluir ainda que são estritamente necessários os nervos parassimpáticos hepáticos para que haja uma maior sensibilidade à insulina nos tecidos periféricos. A segunda parte deste trabalho teve como objetivo avaliar o efeito de uma dieta rica em sacarose (35%) em ratos Wistar machos durante 4, 24 e 36 semanas, na tolerância à glicose periférica e quais os seus efeitos nas proteínas sinápticas envolvidas na formação de vesículas sinápticas responsáveis pela adequada formação de sinapses intervenientes nos processos cognitivos. A diabetes mellitus, quer tipo 1 quer tipo 2, está associada a diversos problemas devido ao aumento dos níveis de glicose no sangue, que levam à disfunção de diferentes órgãos, principalmente rins e olhos e também de vasos sanguíneos. Nos últimos anos têm vindo a aumentar evidências de que a diabetes afeta também o sistema nervoso central, tendo sido denominadas estas alterações por encefalopatia diabética. Doentes diabéticos tipo 1 e tipo 2 têm demonstrado alterações ao nível estrutural e molecular no cérebro, sendo que foram já observadas alterações ao nível das proteínas sinápticas em modelos animais de diabetes tipo 1, levando a alterações nos processos cognitivos. Tendo em conta os estudos descritos, neste trabalho propôs-se a hipótese de que uma dieta rica em sacarose leva a alterações na tolerância à glicose periférica, resultando na diminuição dos transportadores de glicose presente no músculo-esquelético, GLUT4 e GLUT12, assim como à acumulação de massa gorda. Além disso, propôs-se também que esta dieta tem impacto no conteúdo das proteínas sinápticas, quer no hipocampo, quer no córtex. Para a realização deste estudo os animais foram divididos em dois grupos, controlo e sacarose. O grupo sacarose teve acesso a uma solução de sacarose (35%) e o controlo apenas a água, além da ração comum aos dois grupos. No final da dieta, após 4, 24 e 36 semanas foi realizado um teste de tolerância à glicose intra-entérico e posteriormente os animais foram sacrificados e foram-lhes removidos os tecidos: músculo-esquelético, hipocampo e córtex, nos quais foi avaliado o conteúdo proteico utilizando a técnica western blot. A quantificação de massa gorda e massa magra foi realizada através de ressonância magnética noutro grupo de animais submetidos às mesmas condições. Os resultados obtidos neste estudo revelaram que uma dieta rica em sacarose induz o desenvolvimento de intolerância à glicose com diminuição da expressão de GLUT4 e aumento do GLUT12, numa forma compensatória. A acumulação de massa gorda foi também observada nos animais submetidos à dieta rica em sacarose após 24 e 36 semanas de dieta, simultaneamente com alterações no conteúdo das proteínas sinápticas, o que poderá comprometer a função sináptica. Este estudo revela que a homeostase da glicose é um processo chave que influencia não apenas a sensibilidade à insulina nos tecidos periféricos mas também a transmissão sináptica ao nível cerebral. O seu adequado funcionamento é essencial para que não se desenvolva um estado de pré-diabetes, que poderá culminar em diabetes tipo 2.