Desenvolvimento de métodos para estudo de inibidores da acetilcolinesterase (tratamento sintomático da Doença de Alzheimer)

Abstract

A acetilcolina é um neurotransmissor, em grande parte responsável pela aprendizagem e pela formação de memória. Sabe-se que na Doença de Alzheimer, este neurotransmissor encontra-se em concentrações reduzidas devido à diminuição da actividade do enzima colina acetiltransferase, responsável pela sua síntese. Tendo em conta que o enzima acetilcolinesterase (AChE) é o responsável pela hidrólise da acetilcolina, pressupõe-se que a inibição deste enzima possa contribuir para o tratamento sintomático da AD leve a moderada, aumentando os níveis de acetilcolina na fenda sináptica. Por outro lado, sabe-se também que os “chás” tipicamente portugueses têm na sua constituição fitoconstituintes com capacidade inibitória sobre a AChE. O screening destes inibidores é possível através da determinação da sua actividade inibitória, por métodos espectrofotométricos, com base no ensaio de Elman et al.. No entanto, após cada ensaio o enzima é deitado fora sem hipóteses de reaproveitamento. Sabendo que um enzima pode ser imobilizado, e deste modo ser reutilizado, testaram-se diversos métodos de imobilização. Entre os métodos testados um foi seleccionado como o mais promissor. Com este método a imobilização é efectuada em microplacas de poliestireno de 96 poços, recorrendo à activação da mesma com APTES e usando o GA como agente de reticulação. É também utilizada uma molécula espaçadora, o quitosano. Este método provou ser bastante eficiente e estável, sendo possível obter actividades de 0,124 UA/min a qual se manteve estável pelo período de 44 dias. Os perfis de pH e temperatura também foram determinados de modo a avaliar o comportamento do enzima quando imobilizado.

Acteylcholine is a neurotransmitter, in large part responsible for learning and memory formation. It is known that in Alzheimer’s Disease, this neurotransmitter is found in small concentrations due to the decreased activity of the enzyme choline acetyltransferase, which is responsible for its synthesis. Given that the enzyme acetylcholinesterase is responsible for the hydrolysis of acetylcholine, it is assumed that inhibition of this enzyme may contribute to symptomatic treatment of mild to moderate AD, increasing levels of acetylcholine in the synaptic cleft. On the other hand, we also know that typically Portuguese “teas” have phytochemicals in its constitution with inhibitory capacity on AChE. The screening of these inhibitors is possible by determining their inhibitory activity by spectrophotometric methods, based on Elman et al. assay. However, after each test, the enzyme is discarded with no chance of retrieval. Knowing that an enzyme can be immobilized, and thus be reused, we tested several methods of immobilization. Among the methods tested, one was selected as the most promising. With this method, the immobilization is carried out in 96-well microtiter plates, using APTES as activation reagent and GA as crosslinking agent. It is also used a spacer molecule, the chitosan. This method proved to be very efficient and stable, resulting in activities of 0,124 UA/min, which remained stable for a period of 44 days. The pH and temperature profiles were also determined to assess the enzyme’s behavior when immobilized.