Resposta dos linfócitos T ɣδ a tumoures : recrutamento, reconhecimento e funções

Abstract

Tumour immunosurveillance postulates that immune cells are able to eliminate transformed cells, as much as they eliminate pathogens or pathogeninfected cells. This theory constitutes the basis of cancer immunotherapy which explores anti-tumour properties of the immune system (both innate and adaptive) for the treatment of human malignancies. γδ T cells are innate-like lymphocytes that account for a small percentage (1- 10%) of human peripheral blood lymphocytes, but represent the majority of T cells in epithelial tissues. Several properties make γδ T cells attractive targets for cancer immunotherapy, namely their MHC-unrestricted cytotoxicity and unique responsiveness to clinical grade available (phospho) agonists. Despite the promise of γδ T cells in cancer immunotherapy, the clinical success has been limited by low percentages of objective responses. This urges more research on the mechanisms that govern the interactions between γδ T cells and tumours. One of the major gaps in the γδ T cell field is the lack of mechanistic knowledge on tumour cell recognition. We decided to analyze which molecules determine haematological tumour recognition by Vγ9Vδ2 T cells, the major γδ T cell subsets in human peripheral blood. We observed widely variable susceptibility of leukaemia and lymphoma cell lines to Vγ9Vδ2 T cell-mediated cytotoxicity. For those tumours that were efficiently targeted by Vγ9Vδ2 T cells, we found that this required the NK receptor NKG2D, but not the signature T cell receptor (TCR). We then analyzed the expression of NKG2D ligands in susceptible or resistant tumour cells lines, and observed that ULBP1 expression (both at the mRNA level and protein level) segregated with susceptible targets. Through a series of loss- and gain-offunction assays, we demonstrated that ULBP1 constitutes a non-redundant determinant of leukaemia and lymphoma cell recognition by human γδ T cells. Importantly, we observed a dramatic heterogeneity of ULBP1 expression in primary samples obtained from leukaemia and lymphoma patients, which can thus contribute to the highly variable outcomes of γδ T cell-based clinical trials in haematological tumours. Another important limitation to the modulation of γδ T cells in cancer immunotherapy is the lack of molecular cues that direct γδ T cell migration to tumours. Given the pivotal role played by chemokines and their receptors in leukocyte migration, we investigated which chemokines could determine γδ T cell recruitment to tumours. We used the “gold standard” pre-clinical transplantable B16 melanoma model and compared chemokine composition of tumour extracts from WT and TCRδ-deficient mice, and observed an accumulation of the CCR2 ligands, CCL2 and CCL12, in tumour extracts from TCRδ-deficient animals. Interestingly, the comparison of WT and CCR2-deficient hosts revealed increased tumour growth in CCR2-/- mice. Critically, we showed that tumours from CCR2-/- (as well as CCL2-/-) mice contained significantly less infiltrating γδ T cells compared to WT tumours, whereas other T cell populations, particularly CD4+ and CD8+ T cells, were not affected. We also analysed myeloid populations, namely macrophages, neutrophils and myeloid-derived suppressor cells (MDSCs), and observed that, as expected from previous literature, these leukocyte populations were reduced in tumours from CCR2-/- mice. Considering that myeloid cell infiltration into tumours is usually associated with poor prognosis, it is noticeable that CCR2-/- mice displayed increased tumour growth when compared to WT mice. Furthermore, as TCRδ-deficient mice also showed increased tumour burden (compared to WT mice), our data suggests a novel protective role for the CCR2/ CCL2 chemokine pathway through the recruitment of cytotoxic γδ T cells. Considering the significant differences between murine and human γδ T cells, and trying to translate these findings into the human setting, we also investigated if human γδ T cells relied on CCR2 for migration. We observed that the Vδ1 subset expresses CCR2 and migrates towards CCL2 in vitro; by contrast with the Vδ2 population that lacks CCR2 expression, even after activation. Moreover, we observed a dramatic variety of CCL2 levels in several cancer types, with some overexpressing and other downmodulating CCL2 when compared to healthy tissue controls. These data collectively highlight the importance of correlating Vδ1 T cell infiltration with CCL2 expression in situ in future cancer clinical studies. While the potent anti-tumour properties of γδ T cells have been widely demonstrated, some recent reports have implied a pro-tumour role for γδ T cells. We therefore set out to investigate which conditions determine the anti- versus protumour properties of γδ T cells. By comparing two different murine tumour models, B16 melanoma and ID8 ovarian carcinoma, we proposed that the pro-tumour role of γδ T cells may be determined by IL-17 production. TCRδ-deficient mice showed reduced survival (compared to WT) when challenged with B16 tumours, but enhanced survival when challenged with ID8 tumours. We demonstrated an accumulation of IL-17-producing γδ T cells in the peritoneal cavity of ID8 tumour bearing mice that seemed to dominate over anti-tumour IFN-γ production. Importantly, the major source of IL-17 in the ID8 tumour model were γδ T cells, and these expressed higher levels of IL-17 (on a per cell basis) than their CD4+T cell counterparts. In summary, in this thesis we have characterized some key features of γδ T cells in tumour immunosurveillance, namely leukaemia/ lymphoma cell recognition; migration and tumour infiltration; and putative pro-tumour properties. We believe these findings make an important contribution to our understanding of γδ T cell function, and may help to improve current cancer immunotherapy protocols based on γδ T cell activation.

A teoria da imunovigilância do cancro postula que as células do sistema imunitário são capazes de eliminar células transformadas, da mesma forma que combatem patogénios e células infectadas por patogénios. Esta teoria constitui a base da imunoterapia do cancro, a qual explora as propriedades anti-tumorais do sistema imunitário (tanto do sistema inato como do adaptativo) no tratamento de doenças malignas. As células T γδ são linfócitos que constitutem uma pequena percentagem (1-10%) dos linfócitos periféricos do sangue humano, mas que representam a maioria das células T em tecidos epiteliais. Estas células apresentam algumas propriedades que as tornam uma boa aposta para protocolos de imunoterapia para o cancro, como por exemplo, citotoxicidade independente da apresentação de antigénios por moléculas do complexo major de histocompatibilidade (MHC) e reactividade selectiva a fosfoantigénios que podem ser sintetizados em larga escala. Contudo, apesar do entusiasmo inicial, o sucesso clínico do uso de células T γδ tem sido limitado dadas as baixas percentagens de resposta clínica objectiva obtidas. Estes resultados revelam a necessidade de mais investigação acerca dos mecanismos que determinam uma interação produtiva entre células T γδ e células tumorais. Uma das maiores lacunas na biologia das células T γδ são os mecanismos que controlam o reconhecimento de células tumorais. Por esse motivo decidimos analisar quais as moléculas envolvidas na detecção de tumores hematológicos por células Vγ9Vδ2, as quais constituem a maior fracção das células T γδ no sangue periférico humano. Observámos uma grande variabilidade de susceptibilidade de linhas celulares de leucemia e linfoma à citotoxicidade mediada por células Vγ9Vδ2. Verificámos que o receptor NKG2D é necessário, enquanto que o receptor de células T (TCR) é dispensável, para a eliminação de linhas tumorais susceptíveis. Analisámos a expressão de ligandos de NKG2D nas linhas celulares tumorais resistentes e susceptíveis, e observámos que a expressão de ULBP1 (tanto ao nível do mRNA como ao nível da proteína) está associada a tumores susceptíveis. Realizámos ensaios de perda e ganho de função in vitro e concluímos que o ULBP1 é um determinante não redundante do reconhecimento de leucemias e linfomas por parte das células T γδ humanas. De realçar que observámos uma grande heterogeneidade de expressão de ULBP1 em amostras primárias de doentes de leucemia e linfoma, o que poderá contribuir para a variabilidade de respostas observadas em ensaios clínicos hematológicos baseados em células T γδ. Outro aspeto limitante para o sucesso da utilização de células T γδ na imunoterapia do cancro, é a falta de conhecimento dos fatores que controlam a migração e infiltração tumoral das células T γδ . Dado o papel fulcral das quimiocinas e dos seus receptores na migração de leucócitos, investigámos o seu envolvimento o recrutamento tumoral das células T γδ. Usámos o modelo murino pré-clinico de melanoma, baseado na injecção da linha tumoral B16, e comparámos a composição de quimiocinas em extratos proteicos de tumores provenientes de murganhos suficientes (“selvagens”) ou deficientes em linfócitos T γδ (Tcrd-/-), tendo observado uma acumulação de ligandos de CCR2 (CCL2 e CCL12) em extratos tumorais de animais Tcrd−/−. Curiosamente, verificámos também que os murganhos Ccr2-/-apresentavam tumores maiores do que os murganhos selvagens. Analisámos a composição leucocitária e concluímos que os tumores de murganhos Ccr2-/- e também de murganhos Ccl2-/- continham significativamente menos células T γδ infiltrantes do que os murganhos selvagens. Verificámos também que a migração de outras populações de linfócitos T, nomeadamente células CD4+ ou CD8+, não foram afetadas. Analisámos as populações mielóides, incluindo macrófagos, neutrófilos e “myeloid-derived suppressor cells” (MDSCs), e observámos (como previsto na literatura) que estas populações leucocitárias se encontravam reduzidas em tumores originários de murganhos Ccr2-/- . Considerando que a infiltração de tumores por células mielóides está geralmente associada com mau prognóstico, é notável que os murganhos Ccr2-/- apresentem tumores maiores em comparação com murganhos selvagens. Adicionalmente, como os murganhos Tcrd-/- também apresentaram tumores aumentados (em comparação com murganhos selvagens), os nossos dados sugerem uma nova função protetora da via inflamatória CCR2/CCL2 através do recrutamento de células T γδ citototóxicas. Dadas as diferenças significativas entre células T γδ de murganho e humanas, e no sentido de aplicar estas descobertas à medicina, investigámos se as células T γδ humanas dependiam de CCR2/CCL2 para a sua migração. Verificámos que a subpopulação Vδ1 expressa CCR2 e migra para CCL2 in vitro; pelo contrário, a subpopulação Vδ2 não expressa CCR2 (mesmo após ativação)e não responde a CCL2. Adicionalmente, observámos uma grande variabilidade de níveis de expressão de CCL2 em vários tipos de tumores humanos; alguns tipos sobrexpressam, enquanto que outros subexpressam CCL2 comparativamente com os respetivos tecidos saudáveis. Estes dados salientam a importância de correlacionar a infiltração de células T Vδ1 com a expressão de CCL2 in situ em ensaios clínicos futuros. Apesar das potentes propriedades anti-tumourais das células T γδ estarem bem estabelecidas, alguns estudos recentes reportaram uma atividade pro-tumoral das células T γδ. Consequentemente, proposemo-nos investigar as condições que determinam as propriedades anti- ou pro-tumorais das células T γδ. Através da comparação de dois modelos murinos de melanoma (linha B16) e de carcinoma do ovário (linha ID8), mostrámos que o efeito pro-tumoral das células T γδ se associa a elevada produção de produção de interleucina-17 (IL-17). Verificámos que murganhos Tcrd-/- apresentam sobrevivência reduzida (comparado com murganhos selvagens) após transplante do tumor B16, mas sobrevivência aumentada após transplante do tumor ID8. A acumulação de células T γδ produtoras de IL-17 exclusivamente na cavidade peritoneal de murganhos transplantados com tumores ID8, levou-nos a propôr um efeito pro-tumoral dependente de IL-17. É importante notar que a maior fonte de IL-17 nos tumores ID8 foram as células T γδ, e estas que estas expressaram níveis mais elevados de IL-17 (ao nível de cada célula) em comparação com as células T CD4+ . Resumindo, nesta tese caracterizámos vários aspetos-chave da resposta das células T γδ a tumores , nomeadamente o reconhecimento molecular de linfomas e leucemias; os mecanismos de migração e infiltração tumoral; e possíveis propriedades pro-tumorais. Acreditamos que estas descobertas contribuem significativamente para o conhecimento da biologia das células T γδ, e esperamos que possam melhorar os protocolos atuais de imunoterapia do cancro baseados da ativação de células T γδ.