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Authors
Abstract(s)
Mastite é uma doença que ocorre comumente tanto em seres humanos como em animais,
especialmente na indústria leiteira, causando perdas económicas significativas e apresentando
riscos para a saúde pública devido a substâncias prejudiciais e bactérias resistentes a
medicamentos presentes nos produtos lácteos. Staphylococcus spp. destaca-se como o principal
agente causador de infeções intramamárias (IIMs), contribuindo significativamente para as
perdas económicas sofridas pelos produtores de leite. Apesar do aumento de consciência
relativamente à prevalência e consequências da doença, ainda persiste uma considerável lacuna
de conhecimento sobre os mecanismos precisos envolvidos na formação de biofilme por essas
bactérias. A formação de biofilme é um aspeto crucial da persistência da infeção e da resistência
aos antibióticos, tornando-se um foco essencial de pesquisa no campo da mastite.
O objetivo central desta dissertação foi avaliar a capacidade de formação de biofilme de
espécies de Staphylococcus não-aureus isoladas de leite de vacas com mastite e saudáveisde
diversas regiões do Brasil. Para atingir esse objetivo, um total de 135 isolados de
Staphylococcus não-aureus foram submetidos ao teste do Agar Vermelho Congo (AVC), um
método clássico para avaliar a formação de biofilme. Este teste fornece informações sobre a
capacidade de adesão a superfícies e formação de biofilme, que são comunidades intricadas de
micro-organismos protegidas por uma matriz de substâncias poliméricas extracelulares, das
bactérias.
Além da caracterização fenotípica, foi realizada uma triagem genotípica para investigar a
presença de genes de Microbial Surface Components Recognizing Adhesive Matrix Molecules
(MSCRAMMs). Esses genes codificam proteínas responsáveis pela adesão bacteriana aos
tecidos hospedeiros, um passo essencial no estabelecimento da infeção. Compreender a
composição genética destes isolados é crucial para a compreensão do seu potencial de virulência
e patogenicidade. Entre os genes MSCRAMMs examinados verificou-se que 87,4% dos
isolados tinham o gene eno (n=118), o mais prevalente, 11,1% o fib (n=15), 8,9% o clfa (n=12),
7,4% o fnba (n=10), 5,2% o ebps (n=7), 4,4% o clfb (n=6), 3,7% o cna (n=5), e, em menor
extensão, os genes bbp e fnbB em 2,2% dos isolados (n=3). Essa caracterização genética fornece
informações valiosas sobre os mecanismos moleculares subjacentes à adesão e virulência dessas
bactérias.
A dissertação também explora a dinâmica temporal da formação de biofilme por isolados de
Staphylococcus não-aureus. Essa dimensão temporal é crítica, pois permite entender como o
desenvolvimento do biofilme progride ao longo do tempo. A avaliação ocorreu em três
momentos diferentes (24 horas, 48 horas e 72 horas), revelando a capacidade de formação de
biofilme das amostras selecionadas. É importante destacar que este aspeto do estudo visava
descobrir potenciais variações na formação de biofilme em diferentes estágios de
desenvolvimento, lançando luz sobre a persistência e estabilidade de biofilmes formados por
esses isolados. Não se verificou, no entanto, significância nesta avaliação, pelo que após as 24
horas o biofilme estava totalmente formado.
A avaliação da formação de biofilme ocorreu em discos de aço inoxidável, proporcionando uma
superfície prática e relevante para essa avaliação. O aço inoxidável é comumente usado na
indústria de laticínios, especialmente em equipamentos de ordenha e tanques de
armazenamento. A avaliação da formação de biofilme em superfícies de aço inoxidável é, portanto, ecologicamente e agronomicamente relevante, uma vez que está diretamente
relacionada com a contaminação potencial do leite e dos produtos lácteos.
Os resultados desta dissertação demonstram a natureza multifacetada da formação de biofilme
por Staphylococcus não-aureus no contexto da mastite bovina. O teste do Agar Vermelho
Congo revelou que uma proporção significativa dos isolados (18,5%, n=25) exibiu capacidade
de formação de biofilme, destacando ainda mais o potencial patogénico dessas bactérias. A
triagem genotípica forneceu informações sobre as bases genéticas da adesão e virulência,
revelando que esses isolados carregam uma variedade de genes MSCRAMMs, e a sua
proporção, que são fundamentais para a sua patogenicidade.
A análise estatística, com recurso a um teste Q de Cochran, comparou a prevalência de cada gene
com o outcome “formação de biofilme”. O gene fib mostrou influência na formação de biofilme.
Uma análise de variância simples (one-way ANOVA) foi feita para comparar as contagens microbiológicas entre amostras não revelando fortes evidências estatísticas (p>.05). Um teste de
normalidade Shapiro-Wilk para a contagem microbiológica e uma regressão linear para analisar
e comparar a relação entre a presença dos genes e a formação de biofilme foram usados com
recurso ao GraphPad Software, Inc.
É importante destacar que o estudo observou variações na capacidade de formação de biofilme
entre diferentes espécies de Staphylococcus não-aureus. S. chromogenes e S. haemolyticus
emergiram como principais proficientes na produção de biofilme. Essa variação na capacidade
de formação de biofilme entre espécies destaca as diferentes estratégias empregues por essas
bactérias para colonizar e persistir na glândula mamária, enfatizando a complexidade da mastite
bovina como doença.
As contagens microbiológicas dos biofilmes formados variaram entre 5,94 e 9,10 log10 UFC/cm2
,
indicando uma biomassa substancial de micro-organismos na matriz do biofilme. A capacidade
de formar biofilmes tão densos é motivo de preocupação, uma vez que os biofilmes servem como
ambientes protetores para as bactérias, tornando-as mais resistentes a antibióticos e ao sistema
imunológico do hospedeiro. Esta resistência de biofilmes complica o tratamento da mastite, pois
pode exigir abordagens terapêuticas mais agressivas para erradicar infeções associadas a
biofilmes de forma eficaz. Existem potenciais riscos associados ao tratamento com antibióticos,
incluindo a crescente resistência a esses medicamentos por meio da transferência horizontal, e a
emergência de estirpes de Staphylococcus aureus e Staphylococcus não-aureus resistentes à
meticilina (MRSA/MRSNA) em gado. Essa resistência pode ser transmitida entre bovinos e
humanos, principalmente por meio do consumo de produtos como o leite.
Na contagem microbiológica das colónias, os dados das 10 amostras selecionadas, analisados
através de uma regressão logística, sugerem que o gene bbp teve maior influência no biofilme
explicando 33% da sua formação, o eno 10%, os genes cna e clfB 8,3%, o clfA 4,1%, fnbA
3,8%, o fib 2,3% e ebps 2,2%.
Compreender as capacidades de formação de biofilme de espécies de Staphylococcus nãoaureus é fundamental para desenvolver estratégias direcionadas para prevenir e controlar a
mastite em bovinos leiteiros. Ao caracterizar os fatores genéticos e fenotípicos associados à
formação de biofilme, esta pesquisa fornece informações valiosas sobre a virulência e a
persistência dessas bactérias na glândula mamária. As descobertas não apenas avançam o nosso conhecimento sobre a patogénese da mastite, mas também têm implicações práticas para a
indústria de laticínios no Brasil e outros países.
Estas informações podem orientar o desenvolvimento de medidas mais eficazes de prevenção e
controlo, incluindo aperfeiçoamento das práticas de higiene na ordenha, deteção oportuna de
vacas infetadas e terapias com antibióticos direcionadas que possam interromper a formação de
biofilme. Reduzir a prevalência e o impacto da mastite no setor de laticínios é essencial para
melhorar o bem-estar dos animais, manter a qualidade e a segurança dos produtos lácteos e
preservar a viabilidade económica da indústria.
Em resumo, esta dissertação contribui significativamente para a compreensão da mastite e a sua
prevenção no contexto da indústria de laticínios no Brasil. Ao investigar a capacidade de
formação de biofilme de espécies de Staphylococcus não-aureus, contribui para uma melhor
compreensão da virulência e patogenicidade destas bactérias, melhorando a nossa capacidade de
combater esta doença economicamente prejudicial e clinicamente relevante. Os resultados não
são apenas academicamente valiosos, mas também têm implicações práticas para o bem-estar do
gado leiteiro, a qualidade dos produtos lácteos e a sustentabilidade da indústria de laticínios no
Brasil e outros países produtores de leite.
Mastitis is a frequently occurring disease, especially in dairy farming, which causes huge economic losses and brought harmful substance residues, drug-resistant bacteria, and other public health risks. Despite coagulase-negative staphylococci's emerging role in IMIs, understanding biofilm formation mechanisms remains limited. MSCRAMMs are a set of genes that encode for proteins involved in bacterial adhesion to host tissues and confers pathogenicity to the bacteria. This research aimed to assess the biofilm formation ability of strains from Staphylococcus nonaureus species isolated from dairy farms from 5 states of Brazil. In this work, 135 isolates of Staphylococcus non-aureus were submitted to phenotypic Congo Red Agar (CRA) test. Then, genotypic characterization with the screening of MSCRAMMs: bbp, cna, ebps, eno, fib, fnbA, fnbB, clfA and clfB. Lastly, 10 strains with different genotypic profiles along with a known standard strain of Staphylococcus spp. were selected to evaluate the biofilm formation ability through microbiologic counting (log10 CFU/cm2 ). This was measured at three times (24h, 48h and 72h) at the temperature of 25ºC on the contact surface of stainless-steel discs. CRA test showed 18,5% of positivity (n=25). Also, 87,4% of the isolates had the eno gene present (n=118), 11,1% the fib (n=15), 8,9% clfA (n=12), 7,4% fnbA (n=10), 5,2% ebps (n=7), 4,4% clfB (n=6), 3,7% cna (n=5), and bbp and fnbB were present in 2,2% of the isolates (n=3). The factor ‘time growing’ did not have a significant difference in relation to microbiologic counting (p>0,05). S. chromogenes and S. haemolyticus showed the highest biofilm productions. Microbiologic counts were observed in the range 5,94 to 9,10 log10 CFU/m2 showing biofilm formation. This thesis enhances understanding of mastitis pathogenesis in Brazilian dairy cattle by analyzing biofilm formation dynamics among Staphylococcus non-aureus species, revealing genetic factors influencing virulence and highlighting implications for targeted interventions and sector sustainability.
Mastitis is a frequently occurring disease, especially in dairy farming, which causes huge economic losses and brought harmful substance residues, drug-resistant bacteria, and other public health risks. Despite coagulase-negative staphylococci's emerging role in IMIs, understanding biofilm formation mechanisms remains limited. MSCRAMMs are a set of genes that encode for proteins involved in bacterial adhesion to host tissues and confers pathogenicity to the bacteria. This research aimed to assess the biofilm formation ability of strains from Staphylococcus nonaureus species isolated from dairy farms from 5 states of Brazil. In this work, 135 isolates of Staphylococcus non-aureus were submitted to phenotypic Congo Red Agar (CRA) test. Then, genotypic characterization with the screening of MSCRAMMs: bbp, cna, ebps, eno, fib, fnbA, fnbB, clfA and clfB. Lastly, 10 strains with different genotypic profiles along with a known standard strain of Staphylococcus spp. were selected to evaluate the biofilm formation ability through microbiologic counting (log10 CFU/cm2 ). This was measured at three times (24h, 48h and 72h) at the temperature of 25ºC on the contact surface of stainless-steel discs. CRA test showed 18,5% of positivity (n=25). Also, 87,4% of the isolates had the eno gene present (n=118), 11,1% the fib (n=15), 8,9% clfA (n=12), 7,4% fnbA (n=10), 5,2% ebps (n=7), 4,4% clfB (n=6), 3,7% cna (n=5), and bbp and fnbB were present in 2,2% of the isolates (n=3). The factor ‘time growing’ did not have a significant difference in relation to microbiologic counting (p>0,05). S. chromogenes and S. haemolyticus showed the highest biofilm productions. Microbiologic counts were observed in the range 5,94 to 9,10 log10 CFU/m2 showing biofilm formation. This thesis enhances understanding of mastitis pathogenesis in Brazilian dairy cattle by analyzing biofilm formation dynamics among Staphylococcus non-aureus species, revealing genetic factors influencing virulence and highlighting implications for targeted interventions and sector sustainability.
Description
Tese de Mestrado, Biologia Humana e Ambiente, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências
Keywords
MSCRAMMs Mastite Staphylococcus Teste AVC Teses de mestrado - 2024