Characterization of rare CFTR mutations

Abstract

A Fibrose Quística (FQ) é a doença autossómica recessiva mais comum entre a população Caucasiana. Esta doença resulta de mutações no gene Cystic Fibrosis Transmembrane Conduntance Regulator (CFTR), que funciona como um canal regulado pelo cAMP e pelo ATP responsável pelo transporte de cloreto (Cl− ) na superfície apical das células epiteliais das vias respiratórias, rins, intestino, glândulas sudoríparas, pâncreas e trato reprodutor masculino. Adicionalmente uma das funções da CFTR é a secreção de bicarbonato (HCO− 3), que regula o pH do líquido que reveste as vias respiratórias (airway surface liquid - ASL) e a inibição de canais de sódio (Na+ ) epitelial (ENaC), tendo um papel importante da hidratação destas vias e na limpeza mucociliar. O gene que dá origem à proteína CFTR está localizado no cromossoma 7 e é constituído por 27 exões. A proteína é sintetizada por ribossomas associados ao retículo endoplasmático (RE) e é glicosilada cotraducionalmente, produzindo uma forma imatura. Ao longo do tráfego através do Complexo de Golgi, os resíduos glicídicos associados à proteína CFTR são processados gerando uma forma madura que é transportada por vesiculas de secreção até à membrana apical das células epiteliais onde a proteína é ancorada ao citoesqueleto de actina, o que contribui para a sua estabilidade membranar e funcional como canal de Cl− /HCO3 − . A CFTR é um membro da família dos transportadores ABC (ATP binding cassette) composta por cinco domínios distintos: dois domínios transmembranares (MSDS1 e MSD2), que formam o poro do canal; dois domínios de ligação ao ATP (NBD1 e NBD2), e um domínio regulador (R), que contém vários locais de fosforilação, permitindo a abertura e fecho do canal. O folding, tráfego e função da CFTR dependem das interações entre os vários domínios. Desde a sua clonagem em 1989 foram registadas mais de 2,100 variantes no gene CFTR na Cystic Fibrosis Mutation Database (CFMD) sendo a mais comum a deleção de três nucleótidos que leva à deleção do resíduo de fenilalanina na posição 508 (F508del) com uma prevalência de cerca de 80% nos pacientes que sofrem desta doença. Esta mutação leva a um defeito no tráfego e na função devido à formação (folding) incorreta da proteína. Dado o elevado número de variantes descritas no gene CFTR é utilizada uma categorização com base no respetivo defeito causado ao nível da proteína sendo numeradas de I-VII: nas variantes de Classe I não há produção de proteína, sendo normalmente mutações nonsense, nas quais a existência de um codão stop prematuro leva à degradação do mRNA por nonsensemediated decay (NMD); as de Classe II levam ao folding e processamento incorreto da CFTR, ficando a proteína retida no reticulo endoplasmático (RE) e posteriormente degradada pelo sistema ubiquitinaproteassoma; as de Classe III impedem o funcionamento correto do canal, sendo maioritariamente mutações localizadas nos NBDs; as de Classe IV levam a uma baixa condutância, localizando-se maioritariamente nos MSD1 e MSD2; as de Classe V resultam na diminuição dos níveis de CFTR devido a anomalias no promotor e no splicing; nas de Classe VI a proteína é pouco estável na membrana apical da membrana plasmática; e por fim, as variantes de classe VII levam a que não haja produção de mRNA CFTR (p.ex. grandes deleções), sendo muito difícil a sua correção com fármacos atuais. Devido à complexidade da estrutura da proteína CFTR, uma variante pode ser inserida em mais que uma classe - é o caso da F508del que possui defeitos que tanto a classificam como uma mutação de classe II, a proteína mutada é degradada no reticulo endoplasmático, e de classes III e VI uma vez atingindo a membrana apical tem um tempo de abertura e uma estabilidade reduzidos. Nos últimos anos, foram identificados novos fármacos com a capacidade de modificar a expressão, função e estabilidade da proteína CFTR, denominados como corretores e potenciadores – estes compostos atuam na conformação da estrutura que permitem o melhoramento da sua função. De entre as cerca de 2100 variantes descritas no gene CFTR a maioria destas são raras o que dificulta o acesso a materiais para uma melhor caracterização dos efeitos da variante como também testar os fármacos já existentes (e aprovados) para mutações mais comuns. Esta caraterização é imperativa a fim de se poder fazer a validação de compostos que levem à correção especifica de cada mutação. Para o estudo de variações menos comuns é necessário o uso de modelos celulares que consigam reproduzir o fenótipo epitelial em que estas alterações se encontram, nomeadamente linhas celulares provenientes do tecido pulmonar ou bronquial com a capacidade de polarizar e formar tight junctions entre si. Entre os modelos biológicos utilizados para investigação clínica e académica é recorrente o uso de modelos imortalizados, culturas primárias de células epiteliais e organóides (células estaminais primárias presentes nas criptas do epitélio retal) consoante a relevância fisiológica requerida. A necessidade de criação de linhas celulares estáveis é um primeiro passo para entender como a proteína CFTR com variantes raras responde a determinado fármaco. Além disso, uma vez que a maioria das variantes se encontra em heterozigotia com outras mutações, tal dificulta a avaliação do efeito individual de uma variante em indivíduos que sejam heterozigóticos. Por outro lado, estudos in vitro de variantes ainda não estudadas funcionam como base para uma melhor compreensão dos efeitos celulares e moleculares quando não é possível ter acesso a materiais primários derivados dos indivíduos com o genótipo em estudo. Este trabalho teve como principal objetivo a caracterização de variantes raras no gene CFTR - nomeadamente as variantes G458A, A559E, Y563D e Y563C. Estas foram estudadas a nível funcional e molecular, usando novos modelos celulares. Para além disto, testámos se os fármacos já existentes para mutações comuns são eficazes nestas variantes. Para isto foram levadas a cabo as seguintes tarefas: (i) Criação de novas linhas celulares (baseadas na linha CFBE) que sobreexpressam de forma estável cada uma das mutações em estudo; (ii) Estudo do efeito a nível celular por Western Blot (para avaliar o processamento e expressão da CFTR com a finalidade de determinar a quantidade de proteína recuperada) e por Câmara de Ussing (avaliação do transporte transepitelial de Cl- na CFTR, com o uso de células polarizadas); (iii) Avaliação do efeito de corretores (já aprovadas para mutações comuns) nestas novas linhas celulares. Foi analisado o impacto das variantes no processamento da CFTR (presença ou ausência da forma matura da proteína) por Western Blot e posteriormente para a variante G458A foi também estudado o impacto na função da CFTR (determinação de transporte transepitelial em câmara de Ussing). Para as variantes em estudo foram testados o corretor VX-445 e o corretor VX-661, individualmente ou em combinação. Os resultados neste trabalho mostram que: • As variantes G458A, A559E, Y563D e Y563C levam a um defeito no processamento (banda C ausente ou bastante reduzida), podendo ser consideradas mutações de classe II. • O defeito de processamento na mutação G458A é parcialmente corrigido pelo corretor VX-445 e pelo corretor VX-661, individualmente e em combinação. • O defeito de processamento causado pela mutação A559E, Y563D e Y563C não são corrigidas pelos corretores VX-445 e VX-661. Em resumo, esta dissertação cumpriu os objetivos propostos e os resultados apresentados possibilitam a melhor compreensão do efeito de cada mutação e a identificação de compostos que podem levar à sua correção. Uma vez que se continuam a identificar novas variantes (raras) no gene CFTR, a sua própria caracterização é essencial para permitir uma abordagem de medicina personalizada que possibilite o acesso aos novos moduladores, e consequentemente a melhoria da qualidade de vida, a indivíduos com FQ e genótipos raros.

Cystic Fibrosis (CF) is the most common genetic life-shortening autosomal recessive disease, among Caucasians. It is caused by mutations in the gene encoding the CF transmembrane conductance regulator (CFTR) protein. CFTR functions as a chloride channel at the apical membrane of epithelial cells and has an important role in airway hydration and effective mucociliary clearance. Clinically, CF manifests mainly as a respiratory disease; with patients having compromised longevity and quality of life. Nowadays, more than 2100 variants in the CFTR gene have been described, with F508del being the most common mutation accounting for approximately 70% of CF alleles. A large spectrum of additional variants, most of which with rare prevalence, accounts for the remaining CF cases. CFTR mutations were categorized into seven different classes according to the molecular defect they cause – e.g. impairment of CFTR production, processing, function, or stability at the apical membrane. A recent breakthrough in the field happened with the approval of CFTR modulators, small molecules able to act on mutant CFTR protein, correcting its respective molecular defect. However, these drugs do not apply yet to all CF patients, especially because many harbor rare variants for which proper characterization is still missing. The main goal of the present work was to better characterize four novel rare variants (G458A, A559E, Y563D and Y563C), identifying the defect they cause and the response to the correctors elexacaftor and tezacaftor. Our results show that the variants G458A, A559E, Y563D, and Y563C are class II mutations as they impair processing, and that G458A (but not the other variants) can be partially corrected by elexacaftor and tezacaftor, both individually or in combination. Overall, this project contributes to the understanding of the defect caused by rare CFTR variants and to assess their response to CFTR modulator drugs for possible translation into clinical use.