Stem cell-based modelling of cerebellar dysfunction in Angelman Syndrome

Appleton, Carolina Rosa Lã

http://hdl.handle.net/10451/64124

Use this identifier to reference this record.

Name:	Description:	Size:	Format:
TM_Carolina_Appleton.pdf		81.91 MB	Adobe PDF	Download

Send Feedback

Authors

Appleton, Carolina Rosa Lã

Advisor(s)

Bekman, Evguenia

Rodrigues, Maria Gabriela

Abstract(s)

A síndrome de Angelman é uma doença genética rara, sem cura, que afeta o desenvolvimento do sistema nervoso central. É caracterizada por problemas cognitivos severos, problemas de comunicação oral, ataxia e episódios atípicos de riso. A síndrome de Angelman resulta da ausência do gene Ubiquitin Protein Ligase E3A (UBE3A). UBE3A está sujeito a imprinting genético, sendo que o seu alelo paterno é silenciado, e apenas o alelo materno é expresso nos neurónios. Na síndrome de Angelman, alterações moleculares afetam a expressão normal de UBE3A materno, resultando na falta ou alteração da expressão do gene nos neurónios. Ainda permanecem por elucidar bastantes questões referentes aos diversos mecanismos moleculares subjacentes ao fenótipo desta síndrome, e o respetivo papel de UBE3A nos seus sintomas. Modelos in vitro baseados em células pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs) obtidas de pacientes representam uma aproximação do fenótipo humano específico do paciente, muito útil para desenvolver estas questões e potencialmente testar novos tratamentos ou terapias. Entre estes modelos, é de destacar estruturas tridimensionais diferenciadas a partir de hiPSCs, conhecidas como organoides, que mimetizam órgãos de interesse. Os organoides permitem recriar num ambiente controlado, in vitro, estádios do desenvolvimento humano que seriam de outra forma inacessíveis. Especificamente, o cerebelo tem-se mostrado uma área de elevado interesse na patologia da síndrome de Angelman e, através de um protocolo desenvolvido em Silva et al (2020), é possível utilizar hiPSCs de indivíduos afetados para diferenciar organoides de cerebelo. O presente trabalho estudou uma mutação específica presente num indivíduo com Angelman com o intuito de desenvolver o conhecimento sobre esta síndrome. Para tal utilizou-se a linha hiPSC ASD3X, estabelecida a partir deste indivíduo, com uma deleção intragénica in-frame de 3 nucleótidos no alelo materno de UBE3A. A linha ASD3X tinha sido previamente utilizada para a diferenciação de organoides de cerebelo, os quais foram caracterizados em comparação com um controlo derivado de uma linha de hiPSCs de um indivíduo saudável. Esta comparação não permitiu que se distinguisse quais das características observadas se deviam especificamente à deleção de ASD3X, ou à diversidade genética normal entre os dois dadores. Posteriormente, a linha ASD3X foi editada geneticamente com recurso à tecnologia CRISPR/Cas9 para corrigir a deleção. O intuito desta correção era obter linhas hiPSCs controlo com o genoma idêntico à linha ASD3X, mas sem a mutação. Desta forma as linhas corrigidas poderiam servir de controlo isogénico para ASD3X, e permitir afinar e especificar o fenótipo de AS desta mutação. A presente tese propôs completar a caracterização das linhas clonais corrigidas de ASD3X (Cl+1.24, Cl+2.18 e Cl+2.22) e posteriormente diferenciá-las em organoides de cerebelo. O objetivo do projeto era, em última instância, a caracterização definitiva do fenótipo de organoides de cerebelo derivados da linha de hiPSCs ASD3X, de forma a desenvolver uma plataforma que permitisse estudar a progressão da doença in vitro. A primeira parte da presente tese consistiu na caracterização das linhas hiPSC corrigidas de ASD3X, com duas principais vertentes analisadas. Numa primeira fase, o estado de pluripotência e potencial de diferenciação das hiPSCs foi testado. Posteriormente, procurou-se verificar se alguma alteração não intencional teria sido introduzida nestas linhas celulares durante a edição génica com CRISPR/Cas9, e se esta as tinha editado corretamente. A pluripotência e potencial de diferenciação foram confirmados através da obtenção de imagens de imunofluorescência, e da quantificação por RT-qPCR de expressão de marcadores de pluripotência para as três linhas, assim como de marcadores de endoderme, mesoderme e ectoderme. Posteriormente, através de amplificação com PCR e sequenciação de DNA genómico das linhas em estudo, verificou-se que nenhum efeito “off-target” teria sido introduzido, e que as linhas tinham sido corretamente editadas por CRISPR/Cas9, não possuindo a deleção de 3 nucleótidos de ASD3X. No entanto, um estudo recente tinha realçado CRISPR/Cas9 poderia ter introduzido grandes inserções/deleções durante a edição, que não seriam detetadas por estratégias de PCR convencionais seguidas de sequenciação de Sanger. Para salvaguardar esta possibilidade, utilizaram-se sondas Taqman™, para quantificar os alelos presentes nas regiões mais próximas da zona alvo da edição, onde se localiza a deleção de 3 nucleótidos na linha ASD3X. Esta análise levantou algumas questões quanto ao número de alelos presente em Cl+2.22 downstream desta zona alvo, e pareceu confirmar um número de alelos normal em Cl+1.24 e 2.18. Por esta razão, o Cl+2.22 foi excluído de posteriores análises. A segunda parte da presente tese consistiu no uso das duas linhas hiPSC corrigidas de ASD3X, Cl+1.24 e 2.18, para analisar o fenótipo da mutação em organoides de cerebelo. Para tal, o protocolo de diferenciação 3D mencionado acima, de Silva et al. (2020), e previamente utilizado em ASD3X, foi o escolhido. Este foi adaptado e otimizado ao longo do projeto, de forma a permitir originar organoides viáveis para todas as linhas diferenciadas, nomeadamente ASD3X (a linha do paciente), Cl+2.18 e Cl+1.24 (controlos isogénicos de ASD3X), e TcLab/F002.1A.13 (um controlo saudável de outro dador). Para esta otimização, diferentes parâmetros e alterações foram testados, entre os quais diferentes condições para a sementeira inicial dos agregados. Entre estas condições, comparou-se o efeito da utilização de diferentes placas de cultura, assim como diferentes densidades celulares iniciais, no desenvolvimento dos agregados. Para perceber o impacto que qualquer uma destas alterações teria na diferenciação de um controlo analisaram-se os organoides obtidos da linha TcLab. Após esta análise, decidiu-se prosseguir com o estudo de organoides diferenciados com uma densidade celular inicial reduzida comparativamente a Silva et al (2020). Durante a presente tese apenas foi possível realizar uma diferenciação independente por condição/linha testada, pelo que as análises feitas com estes organoides/agregados não foram comparadas com réplicas biológicas. Como tal, não foi possível obter significância estatística para muitas das análises das diferenciações. Posteriormente, prosseguiu-se com a comparação de agregados e organoides derivados da linha TcLab, juntamente com a linha ASD3X e as suas duas linhas isogénicas, Cl+1.24 e Cl+2.18. Para esta análise, quantificou-se a expressão de marcadores de genes importantes durante a diferenciação/especificação do cerebelo através de RT-qPCR, e compararam-se os tamanhos dos organoides obtidos. O intuito era apurar o fenótipo de síndrome de Angelman de ASD3X em organoides de cerebelo. Imediatamente, verificou-se que as linhas Cl+1.24 e Cl+2.18 não demonstravam padrões de expressão semelhantes para a maioria dos marcadores testados. Especificamente, Cl+1.24 afastava-se bastante tanto de Cl+2.18 como de ASD3X e de TcLab. Esta diferença implicava que as linhas Cl+1.24 e Cl+2.18, que deveriam ser geneticamente idênticas, possuíam diferenças genéticas ou epigenéticas, que estariam a impactar o desenvolvimento e diferenciação das respetivas hiPSCs em organoides de cerebelo. Por esta razão, considerou-se que Cl+1.24 teria sofrido alterações genéticas face a Cl+2.18, e prosseguiuse com a análise do fenótipo de ASD3X com apenas o Cl+2.18 como controlo isogénico. Os organoides obtidos através da linha ASD3X foram consequentemente comparados com Cl+2.18 e TcLab, de forma a aferir as características do fenótipo de organoide de cerebelo de síndrome de Angelman de ASD3X. Em suma, foi observado que a especificação do cerebelo, assim como a proporção de neurónios inibitórios e excitatórios, pareceram afetadas em ASD3X. A falta de réplicas experimentais e de consequentes testes estatísticos limita as conclusões que podem ser tiradas perante estas observações. De forma a validar estes resultados, serão necessárias mais análises (por exemplo de imunofluorescência, ou citometria de fluxo), assim como repetições independentes das diferenciações, de forma a poder atribuir significância estatística aos resultados. O presente projeto, em suma, caracterizou três linhas celulares, e otimizou um protocolo de diferenciação de organoides de cerebelo. Apesar de não ter sido possível tirar conclusões definitivas sobre os organoides obtidos, e sobre o fenótipo do indivíduo que originou a linha ASD3X, as observações preliminares do presente projeto guiarão qualquer estudo futuro que utilize este modelo.

Angelman Syndrome (AS) is an incurable neurodevelopmental disease. Disease hallmarks are developmental delay, cognitive and speech impairments, and atypical episodes of smiling and laughter. AS derives from loss of function of the maternal copy of the Ubiquitin Protein Ligase E3A gene (UBE3A), as the paternal copy is physiologically silenced in neurons. Many of the molecular mechanisms underlying AS, and the specific role played by UBE3A in its pathophysiology, however, remain unknown. Patient-derived human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) lines provide a versatile humanproxy in vitro system to study neurodevelopmental conditions such as AS, allowing the recreation of the specific phenotype present in the patient, and the study of early developmental stages of the pathology. The differentiation of patient hiPSCs into organoid models, which recreate the tridimensional cellular structure of organs of interest, such as cerebellar organoids, can be used to study AS cellular and its molecular mechanisms, and potentially test new AS therapies. The present project intended to further analyse the AS phenotype of a patient with a 3bp deletion in UBE3A in cerebellar organoids. With this purpose, the ASD3X cell line, derived from this AS individual, was studied throughout the project. Through CRISPR/Cas9 gene-editing, the deletion of the ASD3X hiPSC line had been previously corrected, originating isogenic control hiPSCs for ASD3X. The present MSc thesis consisted of completing the characterisation of the corrected hiPSCs, and in the differentiation of these cell lines into cerebellar organoids, alongside ASD3X and healthy control cells from a non-AS cell line. Ultimately, this project intended to understand the phenotype of the ASD3X AS pathology in cerebellar organoids. In the end, the corrected hiPSCs were characterized, differentiated into cerebellar organoids through an adapted protocol, and compared to ASD3X organoids. ASD3X cerebellar organoids seemed to comparatively present somewhat impacted cerebellar commitment and a potential imbalance of inhibitory and excitatory neurons. Future studies are needed in order to validate these findings, but the observations made throughout the project will be useful to guide future studies with this model.