Development of an immunotoxin derived from Pseudomonas aeruginosa for the treatment of triple-negative breast cancer

Marimon, Rafaela Pinto

http://hdl.handle.net/10451/62850

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Authors

Marimon, Rafaela Pinto

Advisor(s)

Silva, Frederico Nuno Castanheira Aires da

Cunha, Mónica Sofia Vieira

Abstract(s)

O cancro continua a ser uma das doenças com maior impacto nos humanos e uma das maiores causas de morte a nível global. O maior desafio desta doença é o seu tratamento, uma vez que as abordagens tradicionais, como a cirurgia, a radioterapia e a quimioterapia, podem apresentar resultados positivos, mas a maior parte das vezes apresentam efeitos colaterais significativos e eficácia limitada, particularmente em formas agressivas e avançadas de cancro. Nos últimos anos, tem havido um interesse crescente no desenvolvimento de terapias direcionadas que visam selecionar especificamente as células tumorais, poupando ao mesmo tempo os tecidos saudáveis e reduzindo assim os efeitos secundários. O cancro de mama é o tipo de cancro mais diagnosticado na mulher. Só em 2020, registaram-se cerca de 2,3 milhões novos casos a nível mundial e cerca de 685,000 mortes por esta doença. Para além disso, em Portugal, são detetados cerca de 7,000 novos casos e 1,800 mortes por cancro de mama, anualmente. O TNBC é um subtipo de cancro de mama particularmente agressivo, progressivo e metastático, responsável por aproximadamente 20% de todos os casos de cancro de mama. Estima-se que 13 a cada 100,000 mulheres são diagnosticadas com TNBC todos os anos. Comparado com outros tipos de cancro da mama, o TNBC apresenta uma alta taxa de recorrência, mau prognóstico e baixa taxa de sobrevivência. O TNBC caracteriza-se pela ausência de três marcadores moleculares que são normalmente utilizados como alvo nas terapias para outros subtipos de cancro de mama. A ausência de moléculas-alvo limita as opções de tratamento para o TNBC, uma vez que estes pacientes não podem beneficiar de terapias hormonais ou imunoterapias, em particular, os imunoconjugados, restando-lhes apenas a quimioterapia e radioterapia como principais opções de tratamento. Nesse contexto, tem havido um grande esforço para identificar novos biomarcadores de superfície celular e moléculas terapêuticas inovadoras que possam ser usadas para desenvolver opções de tratamento mais eficazes e seguras para o TNBC, ultrapassando o problema da inespecificidade das terapias atuais. A TROP-2 é uma glicoproteína sobrexpressa na superfície de células tumorais de vários cancros, incluindo no cancro de mama, permitindo assim uma estratégia de direcionamento para a célula-alvo. Têm sido exploradas várias abordagens para o direcionamento das células tumorais utilizando a TROP2. Uma abordagem promissora na terapia direcionada para o cancro é o uso de imunoconjugados. Estes consistem em terapias anti-tumorais específicas, eficazes e com menor toxicidade. São normalmente constituídos por três partes: um anticorpo ou um fragmento de anticorpo que se liga a um antigénio específico da superfície da célula-alvo, uma molécula efetora com atividade citotóxica, e um linker que garante que a molécula efetora permanece ligada ao anticorpo. Os imunoconjugados podem ser classificados em vários subgrupos tendo em conta a molécula efetora utilizada. As imunotoxinas e os ADCs (do inglês Antibody-Drug Conjugates) são os mais relevantes atualmente para o tratamento do cancro. Esta abordagem direcionada oferece várias vantagens, incluindo uma maior especificidade para células tumorais, a redução da toxicidade para tecidos saudáveis e uma eficácia potencialmente melhorada do tratamento. O medicamento Sacituzumab govitecan (nome comercial Trodelvy®) foi o primeiro ADC aprovado pela FDA (do inglês Food and Drug Administration) para o TNBC consistindo num anticorpo recombinante anti-TROP-2 conjugado ao fármaco citotóxico SN-38 que atua através da inibição da enzima topoisomerase I e, consequentemente, induzindo a morte celular. Com a aprovação do Trodelvy® e com outros imunoconjugados em desenvolvimento, torna-se claro que esta nova classe de moléculas terapêuticas está a revelar-se uma estratégia muito promissora para o tratamento do cancro e em particular, para o cancro da mama e o TNBC. No entanto, embora os ADCs estejam em destaque, estas moléculas apresentam ainda alguns desafios, nomeadamente: estabilidade, heterogeneidade na conjugação do citotóxico ao anticorpo, baixa penetração do anticorpo em tumores sólidos e elevados custos de produção. Grande parte destas desvantagens está relacionada com a estrutura convencional do anticorpo (IgG) que é usado para desenvolver um ADC. Na verdade, até ao momento, todos os 12 ADCs aprovados pela FDA no tratamento de diversos cancros têm sido desenvolvidos no formato convencional de um anticorpo IgG. Deste modo, é urgente explorar novos formatos de anticorpos recombinantes. Para além disso, os ADCs baseiam-se na utilização de fármacos químicos e estes apresentam também a desvantagem da resistência que as células começam a desenvolver contra estes químicos. Surgem assim as imunotoxinas. Estas consistem normalmente num fragmento de anticorpo ligado a uma toxina. Esta toxina pode ser derivada de diversas fontes, incluindo bactérias, plantas ou até mesmo alguns animais como as cobras e os escorpiões. Uma das toxinas mais estudadas e utilizadas no desenvolvimento de imunotoxinas é a PE. Esta toxina deriva da bactéria Gram-negativa Pseudomonas aeruginosa e constitui o fator de virulência mais potente desta espécie. A sua atividade envolve a inibição da síntese proteica em células de mamíferos, através da inativação do fator de elongação eEF2, que constitui um fator muito importante para a biossíntese de proteínas. Esta inativação resulta na inibição da síntese proteica e, por consequência, na morte celular. A PE é constituída por três domínios: um domínio de ligação, um domínio de translocação e um domínio catalítico. Para a construção de imunotoxinas, o domínio de ligação é removido e substituído por um anticorpo ou fragmento de anticorpo com afinidade específica para a célula tumoral, evitando assim que esta toxina tenha atividade nas células saudáveis do paciente. A forma mais utilizada da PE é a PE38, uma forma recombinante da PE que contém 38 kDa apresentando uma deleção da maior parte do domínio de ligação, fazendo com que esta versão seja mais curta que a original, mas sem afetar a citotoxicidade da toxina. Várias imunotoxinas que utilizam a PE38 encontram-se em ensaios pré-clínicos e clínicos e uma já foi aprovada pela FDA, como é o caso do Moxetumomab pasudotox, para o tratamento de um tipo de leucemia. Nesta dissertação de mestrado, o objetivo foi o desenvolvimento de uma imunotoxina para o tratamento do TNBC utilizando a PE38. Para desenvolver a imunotoxina específica, um coelho foi imunizado com a proteína TROP-2. O soro do coelho imunizado foi avaliado através de ensaios ELISA, citometria de fluxo e ainda microscopia confocal, onde foi possível confirmar a especificidade dos anticorpos presentes nesse soro e também a capacidade de internalização destes em células TNBC. Após a imunização, construiu-se uma biblioteca de fragmentos de anticorpos de domínio único a partir das células B do coelho imunizado. A biblioteca construída foi então submetida a um processo de seleção, através da tecnologia de phage display, uma técnica promissora que permite a seleção de anticorpos específicos contra um antigénio alvo. Neste processo, a biblioteca foi exposta à proteína alvo, TROP-2. Os fagos que exibiram anticorpos específicos contra a TROP-2 foram selecionados através de múltiplas rondas de ligação, lavagem e eluição. Este processo de seleção teve como objetivo isolar fragmentos de anticorpos de domínio único com alta especificidade para a TROP-2, descartando os menos específicos. Após o processo de seleção, os fagos específicos ligados foram amplificados no início de cada nova ronda de seleção. Posteriormente, o anticorpo mais promissor foi geneticamente conjugado à toxina PE38 através de PCR overlap, resultando na produção de uma imunotoxina específica para o tratamento do TNBC. A imunotoxina foi expressa, utilizando a estirpe E. coli BL21 (DE3), e purificada para posterior avaliação e caracterização. Para avaliar a citotoxicidade da imunotoxina produzida, foi utilizada uma linha celular TNBC, MDAMB-231. Estes ensaios preliminares de citotoxicidade tiveram como objetivo avaliar a atividade citotóxica da imunotoxina e também a especificidade no direcionamento para as células TNBC. Os resultados obtidos demonstraram que a biblioteca de anticorpos produzida apresenta elevada diversidade e complexidade, o que contribuiu para uma seleção de anticorpos específicos bem-sucedida. O anticorpo selecionado, VL20, foi o anticorpo que demonstrou mais especificidade para a TROP-2 e foi então conjugado à toxina PE38. A imunotoxina produzida foi posteriormente testada em células TNBC e apresentou resultados de citotoxicidade promissores. No geral, esta dissertação de mestrado teve como objetivo desenvolver uma terapia direcionada para o TNBC, usando uma imunotoxina derivada de P. aeruginosa. No futuro, serão realizados mais ensaios de citotoxicidade de forma a caracterizar também o seu mecanismo de ação e serão explorados diferentes linkers para melhorar a atividade da imunotoxina. Estudos de eficácia e toxicidade serão posteriormente realizados em modelos animais (murino) de TNBC para avaliar a atividade e segurança da imunotoxina in vivo.

Cancer continues to be a major global health problem. In particular, there were about 2,3 million new cases of breast cancer and about 685,000 deaths from this disease in 2020. In Portugal, about 7,000 new cases and 1,800 deaths are recorded annually. Triple-negative breast cancer (TNBC) is a highly aggressive subtype of breast cancer that represents approximately 20% of all breast cancers and is characterized by the absence of expression of three molecular targets normally found in other types of breast cancer, thus limiting treatment options to chemotherapy and radiation therapy. Targeted therapies offer a more precise approach, focusing on the specific molecular characteristics of cancer cells, reducing side effects on healthy cells. In this sense, there has been a great effort to identify new biomarkers and therapeutic molecules that can be used to develop new and more effective immunotherapies for TNBC, overcoming the non-specificity problem of current therapies. This work aimed to develop an immunotoxin for the treatment of TNBC targeting the TROP-2 protein, which is overexpressed in TNBC cells. The immunotoxin consisted of a single-domain antibody (sdAb) that specifically binds to TROP-2, conjugated to a toxin derived from Pseudomonas aeruginosa (PE38). In this context, a rabbit was immunized with TROP-2 and an immune sdAb library was constructed. Then, the sdAbs were selected through phage display technology. The most promising selected sdAb was conjugated to PE38, thus constructing the immunotoxin. Preliminary cytotoxicity studies showed that the developed immunotoxin presented cytotoxic activity against TNBC cells. More studies will be performed in the future to optimize the therapeutic potential of the immunotoxin herein described in order to evaluate its efficacy and toxicity in pre-clinical phases.