Sea Urchin Inspired Adhesive Proteins – Expression and Purification of Nectin Structural Domains

Abstract

Atualmente, há uma grande procura por adesivos biológicos que sejam eficazes em ambientes aquosos, para aplicações nas áreas da biotecnologia e da biomedicina (por exemplo, para a produção de adesivos cirúrgicos ou como promotores de adesão celular para culturas de células e tecidos in vitro). Na natureza, este tipo de adesivos está muito presente em animais marinhos que usam a adesão para a sua locomoção e alimentação, tais como as estrelas-do-mar e os ouriços-do-mar. Estes animais possuem órgãos especializados para a adesão, os pés ambulacrários, que são constituídos por um caule cilíndrico, responsável pela mobilidade e flexibilidade do pé, e um disco adesivo, que interage com o substrato e é responsável pela produção de secreções adesivas. Os pés ambulacrários possuem uma epiderme duoglandular com células adesivas e de-adesivas, que produzem secreções adesivas e de-adesivas, respetivamente. Estas secreções permitem que os ouriços-do-mar se liguem reversivelmente ao substrato, deixando fixo ao mesmo um círculo de material adesivo. No caso dos ouriços-do-mar, encontra-se descrito que as secreções adesivas são constituídas por uma grande fração inorgânica, glícidos, lípidos e proteínas. Estudos prévios sobre o ouriço-do-mar Paracentrotus lividus identificaram a Nectina-2 como sendo uma proteína importante no processo de adesão destes organismos, uma vez que está sobre-expressa tanto nos pés ambulacrários como nas secreções adesivas. A Nectina-2 é uma proteína de elevado peso molecular (tem mais de 100 kDa) composta por seis domínios discoidina (DS), que lhe permitem ligarse a moléculas com resíduos de galactose e N-acetilglucosamina. Considera-se que estes domínios sejam os principais responsáveis pelas propriedades adesivas da Nectina. Para além disso, esta proteína possui um péptido sinal (com 24 resíduos de aminoácidos), uma sequência LDT, que se pensa ser responsável por manter a interface entre o pé ambulacrário e a secreção adesiva (através de interações com recetores de integrina do tipo α4/β7 nas células da epiderme do disco), e um possível local de sulfatação na Tyr77 (importante local para modificações pós-traducionais para proteínas que passam pela via secretora). A Nectina-2 é ainda passível de sofrer modificações pós-traducionais, tais como fosforilação e glicosilação. Considerando que a produção da proteína Nectina-2, em larga escala, será um processo moroso e provavelmente pouco rentável a nível industrial devido ao seu elevado tamanho e à sua complexa estrutura, o principal objetivo deste trabalho é encontrar uma combinação mais simples de domínios DS que tenha propriedades adesivas comparáveis à proteína completa e com estabilidade adequada à sua produção em larga escala. Deste modo, este trabalho consistiu na otimização dos processos de expressão e purificação de diferentes construtos de Nectina-2, e posterior caracterização bioquímica e estrutural. Para alcançar estes objetivos, foram desenhados seis constructos que foram inseridos em dois vetores diferentes [pHTP1 e pET28b(+)] (obtido como serviço) para expressão de proteínas recombinantes em E. coli. Dos seis constructos, quatro foram expressos com sucesso (constructos C1, C2, C5 e C6). Os constructos inseridos no vetor pHTP1 (constructos C1 e C2) tiveram um nível de expressão de proteína mais elevado que os restantes. Seguidamente testaram-se protocolos de purificação para os diferentes constructos, usando diferentes técnicas cromatográficas. Para os constructos C1 e C6 não foi possível estabelecer protocolos de purificação, pois os protocolos testados falharam na obtenção de proteína pura. Neste sentido no futuro será necessário realizar mais testes. O constructo C2 foi purificado com sucesso através do uso de cromatografia de afinidade (His-trap), tendo-se obtido uma proteína com um grau de pureza de 90-95%. Através de estudos de dicroísmo circular e espectroscopia de fluorescência, percebemos que o constructo purificado tem um fold do tipo α/β (o que vai de encontro às previsões obtidas com o software AlphaFold) e os seus resíduos de triptofano estão parcialmente expostos ao solvente. Para estudar a estabilidade conformacional do constructo C2 em diferentes ambientes, semelhantes aos que a Nectina-2 está exposta quando expressa nos ouriços-do-mar, recorremos a estudos da desnaturação térmica. Deste modo, as condições estudadas foram água do mar artificial (ASW1 - 223 mM NaCl, 30 mM MgCl2, 5 mM KCl, 5 mM CaCl2, 12 mM NaHCO3, 5 mM Hepes pH 8) ou elevada concentração de NaCl (25 mM Tris pH 8, 5% glicerol, 600 mM NaCl) para simular o ambiente marinho, e pH baixo (78 mM tampão Na+ /K+ de fosfato, pH 5.5) para simular o interior dos grânulos secretores, onde proteínas adesivas, como a Nectina-2, são armazenadas antes da sua secreção. Os espectros de emissão de fluorescência dos triptofanos obtidos para o constructo C2, no estado nativo, nos diversos ambientes foram muito semelhantes ao obtido na presença de tampão Tris. Não obstante, após desnaturação térmica na presença de água do mar, no estado desnaturado, observou-se um red shift no máximo de emissão comparativamente ao tampão Tris. Globalmente estes dados sugerem que embora a água do mar artificial possa não causar alterações conformacionais instantâneas na proteína, parece influenciar a sua conformação quando exposta a condições desnaturantes. A fluorescência dos triptofanos foi também usada para seguir a estabilidade térmica da proteína. Os resultados obtidos mostraram que, na maioria das condições estudadas, este processo é cooperativo, e que a temperatura de desnaturação aparente (Tm app) é muito semelhante entre condições (entre 55 e 56 °C). A única exceção foi para o tampão com pH 5.5, neste caso a transição apresentada correspondia a um processo não cooperativo (e por isso não pode ser diretamente comparada com as restantes condições) obtendo-se uma Tm app ligeiramente superior às restantes (58 °C). Outra técnica utilizada para estudar a estabilidade térmica do constructo purificado foi a fluorescência de varrimento diferencial (DSF), recorrendo ao fluoróforo SYPRO Orange, cuja fluorescência aumenta na presença de ambientes apolares, tais como as regiões hidrófobas de uma proteína desnaturada. Novamente, obteve-se um processo de desnaturação cooperativo nas condições estudadas. O facto de os valores de Tm app obtidos na presença de água do mar artificial e de tampão Tris terem sido diferentes (53 e 56 °C, respetivamente), corrobora a influência da água do mar no processo de desnaturação do constructo. Para além disso, o facto de o valor de Tm app ser inferior na presença da água do mar artificial significa que esta condição tem um efeito desestabilizador no constructo, pelo menos quando se considera a exposição de resíduos hidrófobos. Curiosamente, os valores de Tm app obtidos por fluorescência e por DSF na presença de água do mar foram diferentes (56 e 53 °C, respetivamente). Isto pode indicar que, durante o processo de desnaturação térmica, a exposição de resíduos hidrófobos acontece a temperaturas mais baixas do que as alterações ao ambiente circundante dos triptofanos. Seguidamente ainda avaliámos a propensão para este constructo agregar em diferentes condições, uma vez que, em estudos anteriores, foi demonstrado que o adesivo secretado por P. lividus comporta-se como um amiloide funcional. Estes ensaios foram realizados seguindo a dispersão de luz ao longo do tempo, à temperatura ambiente, de uma solução do constructo C2 em tampão Tris versus água do mar artificial (ASW2 - 445 mM NaCl, 60 mM MgCl2, 10 mM KCl, 10 mM CaCl2, 24 mM NaHCO3, 10 mM Hepes pH 8). Interessantemente, em água do mar houve formação de precipitados. Embora estes dados sejam muito preliminares, mais uma vez indicam que a água do mar provoca alterações conformacionais na proteína alvo. No geral, os resultados obtidos neste trabalho poderão vir a contribuir para uma melhor compreensão dos mecanismos de adesão de P. lividus e para o desenvolvimento de novos bioadesivos inspirados em ouriços-do-mar com potencial para aplicações nas áreas da biomedicina ou biotecnologia.

Marine invertebrates produce secretions with outstanding adhesive properties, which can be used as inspiration for the development of new biomimetic adhesives for biomedicine and biotechnological applications. Studies on the sea urchin Paracentrotus lividus identified Nectin-2 as an important adhesive protein, that is present in its adhesive organs and secretions, and could have biomimetic potential. Nectin is a large protein (over 100 kDa) composed of six discoidin-like (DS) domains, making it a laborious model for future use at an industrial scale. The main goal of this project is to discover a simplified version of the Nectin-2 protein with one or more combinations of DS domains (putative adhesive domains) that would simultaneously present suitable adhesive properties and adequate protein stability when compared to the full-length protein. Specifically, for the designed constructs, we will establish and optimize protocols for protein expression and purification. Six different Nectin-2 constructs were designed for bacterial recombinant protein expression, and an extensive protein expression assessment was performed. Four of the constructs were successfully expressed in E. coli. For the latter, a first approach to protein purification was performed using a combination of chromatographic techniques. Construct C2 was successfully purified (90-95% purity). This construct was structurally characterized, and our results showed that it presents a folded conformation with a typical α/β fold. Differential scanning fluorimetry (DSF) and tryptophan emission were used to study protein thermal stability in different conditions. Overall, the thermal denaturation curves indicated a fairly stable protein, although preliminary data suggest that artificial seawater (ASW) can influence protein conformation. Finally, aggregation propensity was also evaluated, and the presence of ASW induces protein aggregation. We believe that our results contribute to the current knowledge on the adhesion mechanisms of P. lividus and open new avenues for the development of sea urchin inspired bioadhesives for biomedical/biotechnological applications.