A carregar...
Publicação
Drug-induced effects on urea synthesis and ammoniagenesis
| Nome: | Descrição: | Tamanho: | Formato: | |
|---|---|---|---|---|
| 2.66 MB | Adobe PDF |
Autores
Resumo(s)
O ciclo da ureia (UC) é uma via metabólica essencial para a eliminação de amónio/amoníaco produzidos pelo metabolismo das proteínas e aminoácidos no fígado. Este processo envolve uma série de reações enzimáticas que convergem na formação de ureia. Certas patologias do ciclo da ureia (UCD) associam-se a níveis elevados de amónio/amoníaco no sangue (hiperamonémia, HA). O equilíbrio químico entre NH4+ (ião amónio) e NH3 (amoníaco) dependerá do pH do compartimento subcelular. Ao pH sanguíneo fisiológico predominará claramente o catião amónio em circulação. O aumento da sua concentração plasmática (hiperamoniémia) é potencialmente grave porque pode evoluir para encefalopatia, uma condição que, embora rara, pode conduzir a coma e morte. Deste modo, a HA é uma alteração metabólica que resulta do desequilíbrio entre a produção e a eliminação de amoníaco (tóxico) através do UC. Esta alteração pode relacionar-se com os efeitos adversos associados à terapêutica com certos fármacos. A possível inibição de reações do UC quer na fase mitocondrial como citosólica, desencadeada pelos referidos fármacos ou seus metabolitos, pode resultar em HA. O ácido valpróico (VPA) frequentemente usado no tratamento de patologias neuropsiquiátricas, usualmente bem tolerado, tem como potencial efeito secundário uma possível HA.
O presente trabalho de investigação visa elucidar de que forma este fármaco (VPA) e o seu éster valproil-CoA (VP-CoA) podem interferir em enzimas mitocondriais que direta ou indiretamente se relacionem com o UC. Pretende-se esclarecer se as interações do fármaco se devem a efeitos diretos ou indiretos sobre uma ou mais enzimas alterando a sua cinética, ou se por exemplo induzem alterações nas modificações pós-tradução de determinadas proteínas (PTMs).
Para estudar os efeitos do tratamento in vivo com VPA, analisaram-se perfis de metabolitos em amostras biológicas (urinas de ratos Wistar) através de métodos de cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa (GC-MS). Estudaram-se os intermediários mitocondriais do ciclo de Krebs com implicações no UC, em urina de ratos controlo versus a de ratos tratados com VPA. Como resultado desta análise, foram observadas diferenças significativas nos níveis de metabolitos de ácidos orgânicos urinários nos animais em que se administrou VPA quando comparados com os animais controlo. Com o objetivo de uma análise metabolómica dirigida, foi desenvolvido um novo método analítico para detetar e quantificar N-acetilglutamato (NAG) por GC-MS. Reconhece-se a importância metabólica da síntese de NAG pela NAGS, como um dos mecanismos potencias na ativação do UC e na patogénese da HA. Deste modo uma redução dos níveis deste metabolito poderá constituir um biomarcador de disfunção do UC.
A glutamato desidrogenase (GDH) é uma enzima que desempenha um papel fundamental na homeostase dos níveis de amónio e/ou glutamato (Glu) no fígado. Apesar da sua função crucial, desconhece-se o efeito do VPA na GDH hepática. Desta forma, o presente projeto visa igualmente investigar a hipótese de existir um potencial efeito do metabolito mitocondrial valproil-CoA (VP-CoA) sobre esta enzima que possa afetar ou alterar a sua ação catalítica em ambas as direções da reação (aminação redutiva do α-cetoglutárico e desaminação oxidativa do Glu). Com este objetivo, foi necessário efetuar uma síntese química do VP-CoA, seguida de purificação e quantificação. Esta síntese foi determinante, na medida em que permitiu a obtenção do composto na sua forma pura, visto não estar disponível comercialmente.
Considerando a reversibilidade da reação mediada pela GDH, o estudo prosseguiu com a otimização de um método espectrofotométrico num leitor de placas para posterior avaliação da atividade da enzima em lisados mitocondriais obtidos a partir de fígado de rato. Assim, recorrendo a GDH purificada de bovino, procedeu-se à avaliação da sua atividade no sentido direto e reverso, em função da respetiva concentração de enzima. Foram também testadas diferentes concentrações de cofatores NAD e NADH dependendo do sentido da reação. Determinou-se também a influência da concentração do substrato α cetoglutarato na velocidade da reação. A aplicação do modelo e equação de Michaelis-Menten permitiu um ajuste aos resultados experimentais e uma estimativa dos parâmetros cinéticos, Km e Vmax, no sentido da aminação redutiva do α cetoglutarato. Em seguida, foi estudado o potencial efeito inibidor do VP-CoA. Os resultados obtidos comprovam que na presença de VP CoA (até 0.5 mM) se verifica uma diminuição inequívoca da atividade da GDH em ambas as direções, por comparação com a ausência do inibidor. Posteriormente, foi caracterizado o mecanismo de inibição do VP-CoA sobre a GDH (direção reversa), para diferentes concentrações de α cetoglutarato (usado como substrato da reação). O decréscimo da atividade da GDH com o aumento da concentração de VP-CoA em função da concentração de substrato, sugere um mecanismo de inibição do tipo misto.
Para estudar o efeito da terapêutica com VPA num modelo in vivo, afetando potencialmente a expressão de GDH e/ou a sua atividade enzimática, esta última foi avaliada em amostras de lisados mitocondriais de fígado de rato. Resultados preliminares sugerem que nos animais em que se procedeu a uma administração aguda ou subcrónica do fármaco, parece existir um ligeiro decréscimo na atividade mitocondrial de GDH.
O presente trabalho demonstra uma interferência clara do fármaco VPA através do seu metabolito VP-CoA sobre a aminação redutiva do α cetoglutarato, podendo sugerir que possa existir um aumento na concentração intracelular de amónio e deste modo contribuir para a HA. Por outro lado, o efeito inibitório do fármaco na aminação do α-cetoglutarato pode contribuir para um decréscimo na formação de Glu. Considerando que os níveis de Glu são determinantes como substrato na produção de NAG através da NAGS, o presente trabalho também suporta a inibição desta enzima já reportada anteriormente pelo nosso grupo como mecanismo de disfunção do ciclo da ureia associado ao VPA.
Serão necessários estudos adicionais para elucidar o funcionamento e regulação in vivo da enzima GDH que envolvem processos complexos. Um dos principais focos de estudo emergirá da compreensão detalhada da SIRT4, dado que é uma das enzimas menos compreendidas e com impacto na GDH. Desconhecem-se as condições metabólicas exatas que modulam o sentido preferencial da reação catalisada pela GDH no fígado. Os diferentes níveis de metabolitos intermediários (α cetoglutarato ou Glu), a presença de outros inibidores (propionil-CoA) e o estado redox mitocondrial (NAD/NADH) terão seguramente um papel fundamental na regulação e atividade da GDH.
Em conclusão, este trabalho contribui para o esclarecimento e compreensão dos mecanismos pelos quais o VPA interfere na atividade da enzima GDH, que por consequência podem afetar direta ou indiretamente o metabolismo do nitrogénio e/ou a função do UC.
Unwanted elevations in plasma ammonia levels, defined as hyperammonemia (HA) may be potentially associated with valproic acid (VPA), an important drug used worldwide to treat various neuropsychiatric diseases. Whether and how the drug-associated disturbances in the urea cycle (UC) may modify the activity of several enzymes related with ammoniagenesis or UC, are aspects not fully elucidated. Therefore, our research plan was to investigate protein function in specific reactions involved directly or indirectly with HA. In this context, different approaches were used for further evaluation of VPA-induced alterations on metabolome, enzyme activity and protein modifications. This work aimed to set up and explore a new analytical method using gas chromatography coupled with mass spectrometry (GC-MS) to detect and quantify N-acetylglutamate (NAG). NAG is an allosteric activator of carbamoyl phosphate synthetase I (CPS I), the enzyme that triggers UC activity. It is produced in the mitochondrial compartment of hepatocytes from acetyl-CoA and glutamate (Glu) through a reaction catalyzed by the enzyme NAG synthase (NAGS). NAG and NAGS play a key role in regulating ammonia detoxification. Due to the central role of glutamate dehydrogenase (GDH) in ammonia and/or Glu homeostasis, we also aimed to elucidate the effect of VPA on hepatic GDH. To assess its activity, a spectrophotometric assay was developed and validated using purified bovine liver GDH. Moreover, considering the reversibility of the GDH mediated reaction, both directions were studied. Since it is not commercially available valproyl-CoA (VP-CoA), the major mitochondrial metabolite of VPA, was synthesized. The potential effect of VP-CoA on GDH activity, was studied in vitro through kinetic studies. VP CoA (0.5 mM) induced a decrease of GDH activity not only in the reductive amination of α-ketoglutarate (ca 50 % of control) but also in the oxidative deamination of Glu (ca 68 % of control). To characterize the effect of VP-CoA on GDH, studies were initiated as a function of α-ketoglutarate concentration and results suggest a mixed-type inhibition mechanism. The obtained data clearly emphasizes a GDH-mediated role on the VPA-associated dysfunction of ammonia detoxification, providing new insights into the pathogenesis of HA observed in patients treated with this drug. This work will contribute to develop further therapeutic strategies that may overcome, avoid and/or treat HA.
Unwanted elevations in plasma ammonia levels, defined as hyperammonemia (HA) may be potentially associated with valproic acid (VPA), an important drug used worldwide to treat various neuropsychiatric diseases. Whether and how the drug-associated disturbances in the urea cycle (UC) may modify the activity of several enzymes related with ammoniagenesis or UC, are aspects not fully elucidated. Therefore, our research plan was to investigate protein function in specific reactions involved directly or indirectly with HA. In this context, different approaches were used for further evaluation of VPA-induced alterations on metabolome, enzyme activity and protein modifications. This work aimed to set up and explore a new analytical method using gas chromatography coupled with mass spectrometry (GC-MS) to detect and quantify N-acetylglutamate (NAG). NAG is an allosteric activator of carbamoyl phosphate synthetase I (CPS I), the enzyme that triggers UC activity. It is produced in the mitochondrial compartment of hepatocytes from acetyl-CoA and glutamate (Glu) through a reaction catalyzed by the enzyme NAG synthase (NAGS). NAG and NAGS play a key role in regulating ammonia detoxification. Due to the central role of glutamate dehydrogenase (GDH) in ammonia and/or Glu homeostasis, we also aimed to elucidate the effect of VPA on hepatic GDH. To assess its activity, a spectrophotometric assay was developed and validated using purified bovine liver GDH. Moreover, considering the reversibility of the GDH mediated reaction, both directions were studied. Since it is not commercially available valproyl-CoA (VP-CoA), the major mitochondrial metabolite of VPA, was synthesized. The potential effect of VP-CoA on GDH activity, was studied in vitro through kinetic studies. VP CoA (0.5 mM) induced a decrease of GDH activity not only in the reductive amination of α-ketoglutarate (ca 50 % of control) but also in the oxidative deamination of Glu (ca 68 % of control). To characterize the effect of VP-CoA on GDH, studies were initiated as a function of α-ketoglutarate concentration and results suggest a mixed-type inhibition mechanism. The obtained data clearly emphasizes a GDH-mediated role on the VPA-associated dysfunction of ammonia detoxification, providing new insights into the pathogenesis of HA observed in patients treated with this drug. This work will contribute to develop further therapeutic strategies that may overcome, avoid and/or treat HA.
Descrição
Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.
Palavras-chave
Valproic acid Valproate-induced hyperammonemia Urea cycle Hyperammonemia Glutamate dehydrogenase N-acetylglutamate Teses de mestrado - 2021