Selection of IGg synthetic libraries By CRISPR induced variability

Abstract

Os anticorpos há muito tempo são considerados componentes essenciais da resposta imunológica adaptativa e têm se tornado ferramentas importantes em diversas áreas, tais como a Biotecnologia, Biologia Molecular, Indústria Farmacêutica ou Medicina. A utilização de anticorpos para identificar e neutralizar elementos patogénicos foi proposta há mais de um século por Paul Ehrlich, na sua “Teoria da cadeia lateral”. Os seus conceitos proporcionaram um avanço no campo da medicina moderna, onde encontrar moléculas específicas que neutralizam antígenos infeciosos ou tumorais pode garantir o sucesso da terapêutica. Devido à sua excelente especificidade, afinidade e estabilidade, os anticorpos são ferramentas de alto valor terapêutico, de diagnóstico, biotecnológico e são o segmento de crescimento mais rápido do mercado de produtos biológicos. Os anticorpos são moléculas estáveis e facilmente manipuláveis por engenharia genética, em que o seu tamanho pode ser alterado e a sua função corrigida mediante a fusão com outros anticorpos, proteínas ou toxinas. Tendo em conta as suas características excecionais, a procura por uma melhor produção e seleção de anticorpos mais eficazes tem vindo a aumentar drasticamente. Porém, as tecnologias disponíveis de seleção de anticorpos que permitem posteriormente aperfeiçoar a afinidade e a estabilidade expõem certas limitações. A tecnologia do hibridoma foi um desenvolvimento pioneiro para a produção de anticorpos monoclonais, imunoglobulinas homogéneas que, por definição, reconhecem um único epítopo. Nesta técnica ocorre a fusão de uma célula do mieloma com um linfócito B. proveniente de um animal imunizado com o antigénio conhecido. No entanto, as diferenças entre o sistema imunológico humano e o do animal originam reações adversas nos doentes tratados com estes anticorpos, o que que conduz à sua rápida eliminação do organismo, à ocorrência de reações de hipersensibilidade e a uma redução na capacidade de atingirem o local alvo de ação e, portanto, uma ineficácia terapêutica. A evolução das tecnologias recombinante e de display permitiram superar a limitação de imunogenicidade com a implementação de uma molécula completamente humana. Tais anticorpos podem ser produzidos por métodos in vivo ou in vitro. O método in vivo consiste em utilizar animais transgénicos, no qual, os genes de imunoglobulinas dos animais são substituídos pelos genes humanos. No caso de desenvolver anticorpos humanos por métodos in vitro, uma técnica bastante utilizada é o Phage Display de anticorpos. Apesar de versátil, a tecnologia de Phage display não é realizada num ambiente de uma célula eucariota, comprometendo a conformação final, tanto das proteínas alvo como dos anticorpos. Consequentemente, durante a fase de seleção a probabilidade de sucesso em ensaios funcionais é diminuída pelo facto dos anticorpos e antigénios não serem apresentados nas suas conformações nativas. Ademais, poderá haver a necessidade de alguns anticorpos, já selecionados, necessitarem posteriormente de modificações para aperfeiçoar a sua função, afinidade ou estabilidade. Desta forma, todo o processo de produção e seleção de um anticorpo eficaz acaba por se tornar mais demorado. É então pertinente, desenvolver novas estratégias que permitam ultrapassar os atuais obstáculos e que possibilitem a produção de anticorpos com maior biodisponibilidade, afinidade e especificidade, com o objetivo de obter uma maior eficácia terapêutica. Reconhecendo a importância desta necessidade, este projeto tem como finalidade desenvolver uma nova tecnologia que permita gerar bibliotecas de anticorpos com elevada variabilidade num sistema celular eucariota, que possibilite selecionar anticorpos funcionais com alta afinidade e contra a expressão de qualquer antígeno na sua forma nativa. A ideia principal desta teoria passa pela mimetização do mecanismo de recombinação V(D)J, que ocorre nos linfócitos B durante a formação dos anticorpos, que consiste na introdução de cortes de cadeia dupla (do inglês DoubleStrand Breaks) em locais específicos do DNA e a sua posterior reparação, que é naturalmente tendenciosa à inserção de mutações no local de corte. Desta forma, para desenvolver este projeto foi utilizado um anticorpo Humano conhecido modificado especificamente para conter sequências-alvo reconhecidas pelo complexo CRISPR/Cas9 (do inglês Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats associated protein 9 nuclease) nas regiões determinantes de complementaridade (do inglês Complementary Determening Regions), para que apenas seja gerada variabilidade nos locais de ligação ao antigénio. O anticorpo modificado foi introduzido no genoma das células 293-F, de modo a gerar aleatoriamente uma biblioteca de anticorpos a partir de uma única sequência de anticorpo. Numa primeira fase foi testada a eficácia de diferentes complexos CRISPR/Cas9 como agentes mutagénicos para a introdução de cortes de cadeia dupla, a fim de estudar a combinação mais propicia à criação de uma biblioteca de elevada variabilidade. Posteriormente à construção da linha celular com o complexo mutagénico escolhido, todas as células mutadas aleatoriamente foram sujeitas a um mecanismo de seleção intracelular para identificar anticorpos com capacidade de ligação à streptavina. Usando a Citometria de Fluxo foi possível selecionar a população positiva para a expressão do anticorpo anti-streptavidina à superfície da célula e isolá-la. Com o trabalho desenvolvido ao longo da tese de mestrado, podemos comprovar que é possível criar um grande repertório de anticorpos com variabilidade intracelular a partir de um único anticorpo. Estas descobertas podem fornecer um grande impacto no desenvolvimento de uma plataforma distinta para a geração de bibliotecas de anticorpos. Ademais, o fato de ter sido utilizada uma IgG Humana para criar esta plataforma, dá-nos a capacidade de superar questões significativas, como a toxicidade ou a tolerância, associadas a imunizações de animais. Esta plataforma única representa um grande progresso para o desenvolvimento de bibliotecas altamente diversificadas, que podem resolver desafios convencionais significativos tornando todo este processo mais rápido e eficaz.

Antibody discovery has become progressively important in almost all areas of modern medicine, where antibody libraries have proven an invaluable resource for the isolation of diagnostic and potentially therapeutic antibodies. Antibody libraries must follow a selection step to collect the leads with the required affinity, specificity and stability. However, the existing display and screening techniques offer some technical obstacles and require an extended protocol being more time-consuming and expensive. Here, we introduce a distinctive mammalian cell system capable of producing antibody libraries that generate its diversity, linked to a display method for a high-throughput selection. Mimicking the V(D)J recombination process that occurs inside B cells to generate diversity, it was possible to generate in situ diversity by inducing double‐strand breaks that would be inaccurately repaired. The diversity process is controlled using a well-known antibody backbone designed to include specific DNA sequences inside the CDRs, recognized by CRISPR/Cas9 nuclease complex. With this new model, we successfully introduced variability inside the CDRs and created a cell-based platform to combine this strategy with a selection mechanism where antigen and antibodies interact in their native form. Overall, the results endorse the proof of concept of a distinct and successful approach capable of selecting antibody binders against streptavidin from a diverse library exposed to different selection mechanisms. This platform increases the likelihood of a selected antibody being well-tolerated and highly effective when employed for the development of therapeutic solutions in humans.