Caracterização dos fungos produtores de patulina: desenvolvimento, agressividade e acumulação de micotoxina em função das características físico-químicas das maçãs

Abstract

Nos dias de hoje existe uma grande preocupação por parte das entidades responsáveis pela segurança alimentar nos níveis de micotoxinas nos géneros alimentícios. A patulina é uma dessas micotoxinas, a qual tem vindo a ganhar grande importância devido aos efeitos tóxicos que provoca no ser humano e nos animais. Esta micotoxina encontra-se sobretudo nas maçãs e nos seus produtos derivados, e é produzida por uma ampla gama de espécies fúngicas do género Penicillium, Aspergillus e Byssochlamys. Penicillium expansum é considerado o principal produtor de patulina. Os estudos realizados com esta micotoxina demonstraram efeitos genotóxicos, embriotóxicos, neurotóxicos, hepatotóxicos e nefrotóxicos. A JECFA (Comissão Conjunta de Peritos em Aditivos Alimentares da Organização das Nações Unidas para Agricultura e Alimentação (FAO) e da Organização Mundial de Saúde (OMS)) estabeleceu como dose diária admissível máxima provisória de patulina (PMTDI) 0,4 µg/kg de peso corporal. A União Europeia estabeleceu limites máximos de patulina nos alimentos de 25 µg/kg para produtos sólidos à base de maçã (inclui compota e puré de maçã) e 50 µg/kg nos sumos de frutos, sumos de frutos concentrados e néctares. Nos frutos, os fungos produtores de patulina necessitam das condições necessárias para produzir essa micotoxina, as quais, dependem de fatores ambientais, como a atividade da água, temperatura, atmosfera, e de fatores químicos e físicos típicos do substrato, como o pH e composição nutricional. Deste modo, o objetivo deste trabalho é caracterizar as principais espécies fúngicas produtoras de patulina e correlacioná-las com as condições ou características das maçãs que favorecem a produção desta micotoxina. Selecionaram-se nove variedades de maçã (Bravo Esmolfe, Fuji, Golden, Granny Smith, Pink Lady, Red Delicious, Reineta, Royal Gala e Starking) e procedeu-se à sua caracterização morfométrica e físico-química. Para a caracterização físico-química das maçãs avaliou-se o pH, o resíduo seco, a cinza, os açúcares totais, a vitamina C e os minerais (cálcio, magnésio, alumínio, ferro, níquel, cádmio, crómio e chumbo). As várias variedades de maçã não apresentaram diferenças estatisticamente significativas (p < 0,05) relativamente à sua composição físico-química. Para quantificar a patulina nas várias variedades de maçã procedeu-se à otimização e validação do método de cromatografia líquida de alta eficiência com detetor de ultra-violeta (HPLC-UV) após extração e limpeza dos extratos de maçã por extração em fase sólida (SPE). O método de HPLC-UV é linear nas gamas de concentração de 10 – 80 µg/L e 20 – 100 µg/L, com coeficientes de determinação (r2 ) superiores a 0,995, coeficientes de variação do método (CVm) inferiores a 5% e com um valor teste inferior ao valor F tabelado da distribuição de Fisher-Snedecor para um grau de confiança de 95%. O método também apresentou uma boa precisão em condições de repetibilidade e de precisão intermédia com valores de desvio padrão relativo inferiores a 10%. O método apresenta uma boa veracidade (erro < 10%). Das variedades testadas as que apresentaram maiores concentrações de patulina (PAT) foram a Granny Smith (29 µg/kg PAT), Fuji (27 µg/kg PAT) e Royal Gala (24 µg/kg PAT), com diferentes graus de apodrecimento, nomeadamente 25%, 50% e 100%, respetivamente. A nível microbiológico os fungos mais frequentes foram Penicillium expansum presentes em todas as variedades de maçãs, Alternaria alternata e Cladosporium sp.

Nowadays there is a great deal of concern from the responsible entities for food safety regarding the levels of mycotoxins in foodstuffs. Patulin is one of these mycotoxins, which has been gaining great importance due to the toxic effects it causes in humans and animals. This mycotoxin is found mainly in apples and their by products, and is produced by a wide range of fungal species of the genus Penicillium, Aspergillus and Byssochlamys. Penicillium expansum is considered the main producer of patulin. Studies with this mycotoxin have demonstrated genotoxic, embryotoxic, neurotoxic, hepatotoxic and nephrotoxic effects. JECFA (Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives) established as the provisional maximum tolerable daily intake dose of patulin (PMTDI) 0.4 μg/kg of the body weight. The European Union has established maximum levels of patulin in foods of 25 μg/kg for solid apple-based products (including apple jam and applesauce) and 50 μg/kg in fruit juices, concentrated fruit juices and nectars. In fruits, patulin-producing fungi need the necessary conditions to produce this mycotoxin, which depends on environmental factors such as water activity, temperature, atmosphere, and chemical and physical factors typical of substrate, such as pH and nutritional composition. Thus, the objective of this work is to characterize the main fungal species that produce patulin and to identify the conditions or characteristics of the apples that favor the production of this mycotoxin. Nine apple varieties (Bravo Esmolfe, Fuji, Golden, Granny Smith, Pink Lady, Red Dellicious, Reineta, Royal Gala and Starking) were selected and their morphometric and physical-chemical characterization were performed. The pH, dry matter, ash, total sugars, vitamin C and minerals (calcium, magnesium, aluminum, iron, nickel, cadmium, chromium and lead) were evaluated for physicochemical characterization of the apples. The various apple varieties showed no statistically significant differences (p <0.05) with respect to their physicochemical composition. To quantify patulin in the various apple varieties, the High Performance Liquid Chromatography with Ultraviolet Detector (HPLC-UV) method was optimized and validated after extracting and cleaning apple extracts by Solid Phase Extraction (SPE). The HPLC-UV method is linear in the concentration ranges 10-80 μg/L and 20 - 100 μg/L, with determination coefficients (r2 ) higher than 0.995, coefficient of variation of the method (CVm) of less than 5% and with a test value less than the F-value of the Fisher-Snedecor test or the Mandel test for a confidence level of 95%. The method also showed good accuracy under conditions of repeatability and intermediate accuracy with values of relative standard deviation less than 10%. The method showed a good accuracy (error <10%). From the varieties tested, the highest levels of patulin (PAT) were found in the Granny Smith (29 μg/kg PAT), Fuji (27 μg/kg PAT) and the Royal Gala (24 μg/kg PAT), with different degrees of decay, namely 25%, 50% and 100%, respectively. At the microbiological level, the most frequent fungi were the Penicillium expansum, present in all apple varieties, Alternaria alternata and Cladosporium sp.