Exploring the neuroprotective role of miR-335 in experimental Parkinson's disease

Abstract

A doença de Parkinson (DP), a segunda doença neurodegenerativa mais comum, é impulsionada pela perda progressiva de neurónios dopaminérgicos na substantia nigra e no estriado. A etiologia da DP é desconhecida, mas tanto fatores genéticos como ambientais parecem desempenhar um papel preponderante na patogénese da doença. Além disso, os microRNAs (miRNAs ou miRs) encontram-se frequentemente desregulados em doenças neurodegenerativas, incluindo na DP. Mais especificamente, resultados do nosso laboratório demonstraram que o miR-335 está significativamente diminuído em diferentes modelos experimentais que mimetizam a DP, bem como em doentes. Em termos de mecanismo, o miR-335 tem como alvo direto Leucin-rich repeat kinase 2 (LRRK2), cuja sobre-expressão tem sido associada a uma maior suscetibilidade para desenvolver a doença. Também demonstrámos que, em linhas celulares de microglia e neuronais. o miR-335 inibe a neuroinflamação induzida por estímulos inflamatórios clássicos, como lipopolisacáridos (LPS) e alfa-sinucleína, e até mesmo pela sobre-expressão de LRRK2. Com este trabalho, pretendemos investigar o potencial do miR-335 para aliviar a morte neuronal induzida por 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP+), uma neurotoxina amplamente usada para mimetizar a DP in vitro. Como esperado, o tratamento de células SH-SY5Y de neuroblastoma humano com 2.5 mM MPP+ durante 48 h, induziu níveis significativos de morte celular determinados pela libertação de adenilato cinase (AK) e ensaios do metabolismo de MTS. Paralelamente, testámos no nosso modelo o potencial neuroprotetor do composto X. Curiosamente, os nossos resultados indicaram que o composto X, estruturalmente semelhante ao fármaco citoprotetor UDCA, mas de uma rota sintética diferente, foi capaz de proteger parcialmente as células da morte celular induzida por MPP+ e o seu efeito protetor foi mais acentuado do que no caso do UDCA e TUDCA. Além disso, estudos realizados fora do âmbito desta tese, também demonstraram a atividade antiapoptótica do composto X em outros tipos de células não neuronais e estímulos tóxicos, o que reforça ainda mais os nossos resultados. No futuro, estudos de otimização química devem ser realizados de forma a melhorar a atividade do composto X e torná-lo mais adequado para ensaios in vivo. Curiosamente, o inibidor geral de caspases, zVAD, reverteu os efeitos tóxicos da neurotoxina MPP+. Para melhor caracterizar o tipo de morte celular associada à toxicidade do MPP+, medimos a atividade e ativação das caspase-3 e -7, moléculas-chave para a execução da apoptose, que se verificaram estar aumentadas. A ativação da apoptose foi ainda confirmada pela avaliação da morfologia nuclear após a coloração com o marcador fluorescente Hoechst. Curiosamente, também descobrimos que a incubação concomitante de células com necrostatina-1 (Nec-1), um inibidor potente da necroptose, abolia a toxicidade mediada pelo MPP+ sugerindo assim um papel adicional para este tipo de morte celular regulada neste modelo. No entanto, nem a ferrostatina-1 nem a liproxstatina-1, fortes inibidores da ferroptose, demonstraram qualquer efeito protetor no nosso modelo, o que nos indica que possivelmente este tipo de morte celular não está a ocorrer, pelo menos nestas condições experimentais. É importante referir que quando transfectámos transitoriamente as células com um precursor específico do miR-335-3p (pre-miR-335-3p), 24 h antes da exposição ao MPP+, os níveis de morte celular diminuíram em comparação com as células transfectadas com um controlo negativo. No que diz respeito à necroptose, a exposição de células transfectadas com controlo negativo ao MPP+ resultou num aumento de 50% na razão entre a proteína MLKL fosforilada (pMLKL) e a sua forma total, e um aumento de 10 vezes na expressão de RIP3, no proteoma insolúvel das células, sugerindo assim a ativação de necroptose. Em contrapartida, o tratamento com MPP+ não alterou os níveis de RIP1, o que não invalida a existência de necroptose, porque estudos indicam que este tipo de morte celular pode ocorrer de forma independente da RIP1. Contudo, é curioso que a Nec-1, um inibidor da atividade cinase da RIP1, proteja as células da toxicidade provocada por MPP+. Podemos especular que estes efeitos resultam de atividades off-target da molécula. Em geral, os nossos resultados indicam um papel importante do miR-335 na proteção contra a morte celular induzida por MPP+. Enquanto que a morte celular por apoptose parece ser a via de sinalização induzida preferencialmente pela neurotoxina e o alvo do miR-335, os resultados da ativação da necroptose requerem confirmação adicional. Para caracterizar ainda mais o mecanismo de ação do miR-335 e porque a necroptose é um tipo de morte celular inflamatória, colocámos a hipótese de que a inibição da necroptose pelo miR-335 também poderia resultar na diminuição da inflamação. Uma característica marcante da DP é a neuroinflamação crónica caracterizada pela ativação microglial e níveis mais elevados de mediadores pró-inflamatórios. Por outro lado, o MPP+ parece promover a expressão dos marcadores pró-inflamatórios TNFα, COX-2 e NLRP3, em células SH-SY5Y. Em conjunto, os nossos resultados parecem sugerir um papel para o miR-335 na atenuação da inflamação associada ao MPP+ no nosso modelo; no entanto, são necessárias mais experiências para confirmar estas descobertas. A ativação da morte celular por piroptose também merece ser explorada no nosso modelo. Finalmente, seria interessante avaliar a ativação de vias de sinalização inflamatória clássicas, incluindo JNK, p38 e ERK1/2, bem como a ativação NF-κB, que é um mediador-chave na resposta inflamatória. Compreender a interação entre a diferentes vias de sinalização é essencial para a criação de novas e mais eficazes estratégias terapêuticas. Com este trabalho foi implementado e otimizado um modelo robusto para o estudo dos mecanismos de morte celular associados à DP, usando a linha celular de neuroblastoma humano, SH-SY5Y, exposta à neurotoxina MPP+, e contribuímos com novo conhecimento sobre o potencial neuroprotetor do miR-335 na patogénese desta doença. Em particular, avançámos com resultados in vitro que indicam que a sobre-expressão do miR-335 pode vir a traduzir-se numa abordagem terapêutica promissora e inovadora para travar a neurodegenerescência associada à DP, através da inibição da morte celular por apoptose e possivelmente necroptose, bem como da neuroinflamação.

Parkinson’s disease (PD), the second most common neurodegenerative disease, is driven by the progressive loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra and striatum. The etiology of PD is unknown, but both genetic and environmental factors appear to play a role in disease pathogenesis. Also, microRNAs (miRNAs or miRs) are frequently deregulated in neurodegenerative diseases, including PD. We have previously shown that miR-335 is significantly downregulated in different PD-mimicking conditions and in patients. In terms of mechanism, miR-335 directly targets the leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) mRNA, which has been associated with higher susceptibility to develop PD when overexpressed. We have also shown that miR-335 halts chronic neuroinflammation effects induced by classical inflammatory stimuli or even LRRK2-Wt overexpression in both microglia and neuronal cell lines. Here, we aimed at investigating the potential of miR-335 to alleviate neuronal death induced by 1-Methyl-4-phenylpyridinium (MPP+), a neurotoxin widely used to mimic PD in vitro. As expected, treatment of SH-SY5Y human neuroblastoma cells with 2.5 mM MPP+, for 48h, induced significant levels of cell death as determined by adenylate kinase (AK) release and 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS) metabolism assays. In parallel, we used our model to test the anti-apoptotic potential of a newly synthetized compound, here called compound X, structurally similar to ursodeoxycholic acid (UDCA). Interestingly, our results indicated that compound X was able to partially protect cells from MPP+-induced cell death. Moreover, studies performed beyond the scope of this thesis, also demonstrated the anti-apoptotic activity of compound X in other non-neuronal cell types and toxic stimuli, which further reinforces our results. Pan-caspase inhibitor zVAD counteracted MPP+-driven toxic effects. To further characterize this type of cell death, we measured the activity and activation of caspase-3 and -7, key executioners of apoptosis, which were found to be increased. Activation of apoptosis was further confirmed by evaluation of nuclear morphology after Hoechst staining. Interestingly, we also found that co-incubation of cells with necrostatin-1, a potent inhibitor of necroptosis, abolished MPP+-mediated toxicity, thus suggesting an additional role for this type of regulated cell death in this model. Importantly, when we transiently transfected cells with a specific miR-335-3p precursor (pre-miR-335-3p), 24 h prior to MPP+, the levels of cell death decreased as compared with control cells transfected with a pre-miR negative control. Regarding necroptosis, insoluble protein fractions in negative control-transfected cells with MPP+ showed a 50% increased ratio between phosphorylated MLKL (pMLKL) and its total form and a 10-fold increase of RIP3 expression, thus suggesting necroptosis activation. In contrast, MPP+ treatment did not increase RIP1 total levels; however, this is not an objection for the occurrence of necroptosis. Nonetheless, it is puzzling that Nec-1, an inhibitor of RIP1 kinase activity, protected SH-SY5Y cells from MPP+-toxicity. We may speculate that these effects result from off-target activities of Nec-1. Overall, our results indicate an important role of miR-335 in protecting from MPP+-driven cell death. While apoptosis appears to be the preferential MPP+-induced regulated cell death pathway and miR-335 target, results from necroptosis activation require further confirmation. A hallmark feature of PD is chronic neuroinflammation characterized by microglial activation and higher levels of pro-inflammatory mediators. In the present study, MPP+ seems to trigger the expression of pro-inflammatory tumor necrosis factor α (TNFα), Cyclooxygenase-2 (COX-2) and NLR protein pyrin domain containing 3 (NLRP3), in SH-SY5Y cells. Collectively, our preliminary results suggest a role for miR-335 in attenuating MPP+-associated inflammation in neuronal-like cells; however more experiments are needed to strength our findings. In conclusion, it was implemented and optimized a robust in vitro model of neuroblastoma cell line, for studying regulated cell death mechanisms associated with PD. Further, miR-335 overexpression was identified as a potential neuroprotective tool through inhibition of apoptosis, and possibly necroptosis and inflammation.