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Publicação
Bonding microbial glycolipids to medical grade silicone surface for biofilm formation prevention
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Autores
Resumo(s)
As infeções associadas a cuidados de saúde (IACS), especialmente as associadas a cateteres, são consideradas a principal desvantagem do uso de dispositivos médicos. A IACS foi definida pela Organização Mundial e Saúde como uma infeção adquirida por um paciente após 48 horas ou 30 dias da prestação de um cuidado de saúde. O número de episódios de IRAS tem aumentado em todo o mundo apresentando impacto significativo na qualidade de vida dos pacientes. As principais consequências incluírem maior número de mortes e maior permanência em hospitais acompanhada de maiores custos.
Uma vez que os cateteres representam ferramentas vitais em aplicações de saúde, as infeções relacionadas a cateteres surgem como uma complicação que deve ser tratada. Muitos dos materiais usados na fabricação de cateteres possuem limitações. Um dos biomateriais mais usados na fabricação de cateteres é o polidimetilsiloxano (PDMS) vulgarmente designado por silicone. É classificado como um material biocompatível, económico e transparente, apresentando como desvantagem a hidrofobicidade. A superfície hidrofóbica do PDMS aumenta a fixação bacteriana e a colonização, conduzindo à formação de biofilme.
Neste campo, a modificação de superfície é uma técnica em desenvolvimento amplamente utilizada para prevenir HAIs. Uma ampla variedade de abordagens tem vindo a ser desenvolvida para superar essa limitação do PDMS e também para melhorar a utilização de moléculas antibacterianas. Vária estratégia tem vindo a ser estudadas e.g. revestimento, incorporação e modificação química. A maioria dessas estratégias visa a eluição de moléculas de antibióticos ou antimicrobianos, ou a eliminação de bactérias por contato. Além disso, as abordagens anti-adesivas que envolvem a alteração de superfícies para prevenir a adesão bacteriana também são uma abordagem possível. A pesquisa contínua levou a superfícies modificadas avançadas, algumas delas aprovadas pelo FDA e usadas em clínica, como cateteres impregnados com rifampicina/ minociclina.
Uma vez que o problema da resistência bacteriana pode condicionar o uso de antibióticos na modificação de superfícies o uso de outras moléculas como glicolípidos com atividade antibacteriana pode ser uma boa abordagem. Os glicolipídios antimicrobianos são um grupo pioneiro de compostos biossintetizados que tem atraído a atenção de investigadores. Eles não desenvolvem resistência e atuam como biostensioactivos. Ramnolípidos (RLs) e soforolípidos (SLs) são glicolipídios com aplicação em produtos farmacêuticos e cosméticos. Os primeiros podem aparecer como mono e di-ramnolípidios que diferem no número de frações ramnose. Por outro lado, os SLs também se dividem em forma lactónicas ou acidica com diferentes atividades antibacterianas. Ambos os biostensioactivos atuam como agentes anti-aderentes com propriedades antibacterianas, impedindo a fixação bacteriana à superfície.
As abordagens de modificação química dependem das propriedades físico-químicas da superfície do biomaterial. Moléculas com características antimicrobianas podem ser ligadas à superfície diretamente ou por meio de um agente ligante. Pode envolver o uso de superfícies energizadas (e.g., UV, plasma de O2), revestimento por ligação covalente (e.g., inserção em polímeros) e adição de monocamadas perpendiculares à superfície (e.g. escovas). A modificação da superfície usando a oxidação química é uma das abordagens químicas que pode
v
ser utilizada para ativar a superfícies às quais se irá ligar em seguida moléculas antimicrobianas. Por exemplo, a ativação da superfície do PDMS pela reação de oxidação com solução piranha resulta na formação de grupos silanol como prontos para ligação. Outros grupos âncora podem ser adicionados à superfície e exemplo são agentes de silanização como 3-aminopropiltrietoxissilano (APTES). As moléculas APTES oferecem um grupo amino que pode ser ligado a grupos funcionais de a agentes antimicrobianos.
Por outro lado, uma abordagem bioinspirada de tratamento de superfície usando um revestimento de dopamina pode também ser uma abordagem. Esse revestimento é vantajoso uma vez que é biocompatível, simples e de baixo custo. É bem conhecida a incorporação de uma ampla variedade de moléculas ou polímeros antimicrobianos no revestimento de polidopamina. A polidopamina polimeriza na superfície formando uma camada que pode oferecer possibilidades extras de ligação.
Este estudo tem como objetivo projetar dois revestimentos diferentes de PDMS. A primeira estratégia de revestimento envolveu a oxidação química usando com solução piranha e incorporação de RLs na superfície. Na segunda estratégia recorreu-se de um revestimento bioinspirado com polidopamina (PDA) incorporando mistura de SLs. A otimização dos padrões de oxidação química foi realizada antes da modificação da superfície. Além disso, foram desenvolvidos revestimentos de camada única e dupla com polidopamina-SLs.
Os RLs foram isolados por cromatografia flash enquanto SLs foram biossintetizados por Starmerella bombicola. Ambas as misturas de biotensioactivos foram ainda caracterizadas por TLC e HPLC-ESI-MS. Todos os glicolipídios antimicrobianos foram separados, caracterizados e aplicados com sucesso nas duas modificações.
A modificação da superfície foi avaliada por medidas do ângulo de contato e espectros FTIR-ATR. A atividade antibiofilme foi determinada para a mistura de RLs contra S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 28319, S. aureus ATCC 6538 e Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), e para o RL isolado (RhaRhaC10: 0C10: 0) contra S. aureus ATCC 25923. A atividade antibiofilme da PDA-SLs revestimento foi testado contra S. aureus ATCC 25923. O ensaio de adesão celular de substratos de PDMS funcionalizados com RLs foi avaliado usando o ensaio de MTT. Além disso, a irritação de vasos e membranas foi testada pelo ensaio HET-CAM. Para amostras revestidas com PDA, a citocompatibilidade também foi avaliada usando o ensaio de redução de MTT e o ensaio de exclusão de iodeto de propídio.
Diferente mono e di-RLs foram identificados tendo-se isolado RhaC8:0C8:0, RhaRhaC10:0C12:1/RhaRhaC12:1C10:0 e RhaRhaC10:0C10:0. A mistura e o composto isolado RhaRhaC10:0C10:0 foram selecionados para funcionalizar a superfície do PDMS.
Através do ângulo de contacto do PDMS modificado foi possível observar elevada redução da hidrofobicidade dos substratos PDMS funcionalizados com mistura de RLs e RL isolado, (RhaRhaC10: 0C10: 0), atingindo 17˚ um ângulo plano imensurável, respetivamente.
Bandas caraterísticas foram detetadas nos espectros ATR-FTIR do substrato PDMS-RLs. Para a mistura de RLs, duas bandas em 1124 cm-1 e 1629 cm-1 atribuídas às vibrações C-O-C e C = O da ramnose e do ácido carboxílico, respetivamente. Por outro lado, duas bandas fracas foram
observadas em 844 cm-1 e 940 cm-1 em espectros de dirhamnolipídeos purificados correspondentes a piranil I e α-piranil II, subsequentemente.
A mistura de RLs e o RL isolado mostraram inibição biofilme observando-se uma redução de 4-Log contra S. aureus ATCC 25923 após em 24 horas. Além disso, o RL isolado pode prevenir a colonização bacteriana e reduzir o biofilme da mesma bactéria em 1.6-Log.
O MTT do PDMS modificado mostrou baixa aderência celular após 5 dias de incubação, indicando uma resistência do PDMS funcionalizado em aderir aos fibroblastos. Além disso, o ensaio de HET-CAM ilustrou a segurança do PDMS modificado, uma vez que nenhuma hemorragia ou lise de vasos foi mostrada na membrana durante o tempo de incubação.
A caracterização dos SLs por HPLC-ESI-MS mostrou um conteúdo variado entre SLs acídicos de-, mono- e diacetilados combinados com SLs lactónicos mono- e di-acetilados. A maioria eram SLs diacetilados lactónicos incluem uma cadeia de ácido gordo C18:0, C18:1 e C18:2. Para a funcionalização foi usada a mistura de SLs em uma camada de revestimento ou em camada dupla.
O PDMS com um revestimento polidopamina incorporando SLs em monocamada baixou a hidrofobicidade confirmada pela medição do ângulo de contato (cerca de 31˚). O ângulo de contato dos substratos com revestimento duplo foi cerca de 39,5˚. Os espectros de FTIR representavam as bandas características de SLs e polidopamina na superfície do PDMS. Uma banda forte em 1069 cm-1 foi atribuída a C-O na parte do açúcar SL lactónico, e uma banda em 1458 cm-1 associada à amida na polidopamina.
A formação de biofilme foi moderadamente inibida em PDMS com revestimento de PDA-SLs. Uma redução de 1,25-Log e 1,5-Log de revestimento de camada única e dupla foi observada, respetivamente. Houve uma ligeira diferença quando as amostras foram testadas em dois períodos de incubação, 3 h e 24 h.
Os ensaios de citocompatibilidade de MTT e iodeto de propídio mostraram um bom perfil de segurança de PDMS com revestimento de PDA e SLs. Nenhum efeito citotóxico foi observado para ambos os revestimentos aplicados nos ensaios de citocompatibilidade.
Ambas as estratégias mostraram atividade promissora contra a formação de biofilme e podem ser novas abordagens para a prevenção de HAIs.
Health associated infections (HAIs), particularly catheter-related, are considered as a major drawback of using medical devices in healthcare facilities. HAI is a common reason that lies behind the increased mortality rate worldwide. Surface modifications of medical devices is a developing technique widely used to prevent HAIs. Microbial biosurfactants as rhamnolipids (RLs) and sophorolipids (SLs) are naturally produced anti-adhesive molecules with antibacterial properties. This study aims at designing two different coatings of polydimethylsiloxane (PDMS), the silicone that is widely used in catheters fabrication. The first strategy of coating involved chemical etching using piranha reaction and RLs incorporation into the surface. While the second strategy depended on a bioinspired coating with polydopamine (PDA) incorporating SLs mixture. Purchased RLs were isolated by flash chromatography while SLs were biosynthesized by Starmerella bombicola. Both biosurfactants mixtures were further characterized by TLC and HPLC-ESI-MS. All antimicrobial glycolipids were successfully separated, characterized, and applied in the selected modifications. Surface modification was evaluated by contact angle measurements and FTIR-ATR spectra. The antibiofilm activity was determined for RLs mixture against S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 28319, S. aureus ATCC 6538 and a clinic Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), and for isolated rhamnolipid ( RhaRhaC10:0C10:0) against S. aureus ATCC 25923. The antibiofilm activity of PDA-SLs coating was tested against S. aureus ATCC 25923. Cell adhesion assay of PDMS substrates functionalized with RLs was evaluated using MTT assay. Also, the irritation of vessels and membranes was tested by HET-CAM assay. For PDA coated samples, cytocompatibility was also evaluated using MTT reduction assay and Propidium Iodide exclusion assay. Different mono and di-rhamnolipids were isolated (i.e., RhaC8:0C8:0, RhaRhaC10:0C12:1/RhaRhaC12:1C10:0 and RhaRhaC10:0C10:0) with a vast majority of dirhamnolipids. Optimization of oxidation time, APTES conditions, and rhamnolipid solution concentration showed better surface modification. The contact angle of modified PDMS showed a high reduction on the hydrophobicity of PDMS substrates functionalized with RLs mixture and isolated RL (i.e., RhaRhaC10:0C10:0), reaching 17˚ and unmeasurable flat angle, respectively. Characterized bands were detectable in ATR-FTIR spectra of PDMS-RLs substrate. For RLs mixture, two bands at 1124 cm-1 and 1629 cm-1 were attributed to C-O-C and C=O vibrations in rhamnose and a carboxylic acid, respectively. On the other side, two weak bands were observed at 844 cm-1 and 940 cm-1 in purified di-RL spectra corresponding to pyranyl I and α-pyranyl II, subsequently. iii Functionalized specimens with RLs mixture and isolated RL showed high antibiofilm inhibition around 4-Log reduction of S. aureus 25923 formed colonies on PDMS within 24 hours. Also, isolated rhamnolipid could prevent bacterial colonization and reduced the biofilm of the same bacteria by 1.6-Log. MTT of modified PDMS showed low cell adherence after 5 days of incubation, indicating a resistance of functionalized PDMS to adhere to fibroblasts. Moreover, the assay of HET-CAM illustrated the safety of modified PDMS since no hemorrhage or vessels lysis was shown in the membrane during the incubation time. Characterization of SL by HPLC-ESI-MS showed a content varied between mono- and de-acetylated acidic SLs combined with mono- and di-acetylated lactonic SLs. The majority were lactonic diacetylated SLs include C18:0, C18:1 and C18:2 fatty acid chain. The mixture was used in one-layer and double-layer coating for surface modification. PDMS with a polydopamine mono-layer coating incorporating SLs showed enhanced hydrophilicity in contact angle measurement that was around 31˚. The contact angle of double-coated substrates was around 39.5˚.FTIR spectra represented the characteristic bands of SLs and PDA on the PDMS surface. A strong band at 1069 cm-1 was attributed to C-O in sugar part of lactonic SLs, and a band at 1458 cm-1 represented the amide in PDA. Biofilm formation was inhibited moderately on PDMS with PDA-SLs coating. A reduction of 1.25-Log and 1.5-Log of mono and double-layer coating was shown, respectively. There was a slight difference when two incubation periods included 3 h and 24 h were tested. Both assays of MTT and propidium iodide showed a good safety profile of PDMS with PDA and SLs coating. No cytotoxic effect was shown for both applied coatings in cytocompatibility assays.
Health associated infections (HAIs), particularly catheter-related, are considered as a major drawback of using medical devices in healthcare facilities. HAI is a common reason that lies behind the increased mortality rate worldwide. Surface modifications of medical devices is a developing technique widely used to prevent HAIs. Microbial biosurfactants as rhamnolipids (RLs) and sophorolipids (SLs) are naturally produced anti-adhesive molecules with antibacterial properties. This study aims at designing two different coatings of polydimethylsiloxane (PDMS), the silicone that is widely used in catheters fabrication. The first strategy of coating involved chemical etching using piranha reaction and RLs incorporation into the surface. While the second strategy depended on a bioinspired coating with polydopamine (PDA) incorporating SLs mixture. Purchased RLs were isolated by flash chromatography while SLs were biosynthesized by Starmerella bombicola. Both biosurfactants mixtures were further characterized by TLC and HPLC-ESI-MS. All antimicrobial glycolipids were successfully separated, characterized, and applied in the selected modifications. Surface modification was evaluated by contact angle measurements and FTIR-ATR spectra. The antibiofilm activity was determined for RLs mixture against S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 28319, S. aureus ATCC 6538 and a clinic Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), and for isolated rhamnolipid ( RhaRhaC10:0C10:0) against S. aureus ATCC 25923. The antibiofilm activity of PDA-SLs coating was tested against S. aureus ATCC 25923. Cell adhesion assay of PDMS substrates functionalized with RLs was evaluated using MTT assay. Also, the irritation of vessels and membranes was tested by HET-CAM assay. For PDA coated samples, cytocompatibility was also evaluated using MTT reduction assay and Propidium Iodide exclusion assay. Different mono and di-rhamnolipids were isolated (i.e., RhaC8:0C8:0, RhaRhaC10:0C12:1/RhaRhaC12:1C10:0 and RhaRhaC10:0C10:0) with a vast majority of dirhamnolipids. Optimization of oxidation time, APTES conditions, and rhamnolipid solution concentration showed better surface modification. The contact angle of modified PDMS showed a high reduction on the hydrophobicity of PDMS substrates functionalized with RLs mixture and isolated RL (i.e., RhaRhaC10:0C10:0), reaching 17˚ and unmeasurable flat angle, respectively. Characterized bands were detectable in ATR-FTIR spectra of PDMS-RLs substrate. For RLs mixture, two bands at 1124 cm-1 and 1629 cm-1 were attributed to C-O-C and C=O vibrations in rhamnose and a carboxylic acid, respectively. On the other side, two weak bands were observed at 844 cm-1 and 940 cm-1 in purified di-RL spectra corresponding to pyranyl I and α-pyranyl II, subsequently. iii Functionalized specimens with RLs mixture and isolated RL showed high antibiofilm inhibition around 4-Log reduction of S. aureus 25923 formed colonies on PDMS within 24 hours. Also, isolated rhamnolipid could prevent bacterial colonization and reduced the biofilm of the same bacteria by 1.6-Log. MTT of modified PDMS showed low cell adherence after 5 days of incubation, indicating a resistance of functionalized PDMS to adhere to fibroblasts. Moreover, the assay of HET-CAM illustrated the safety of modified PDMS since no hemorrhage or vessels lysis was shown in the membrane during the incubation time. Characterization of SL by HPLC-ESI-MS showed a content varied between mono- and de-acetylated acidic SLs combined with mono- and di-acetylated lactonic SLs. The majority were lactonic diacetylated SLs include C18:0, C18:1 and C18:2 fatty acid chain. The mixture was used in one-layer and double-layer coating for surface modification. PDMS with a polydopamine mono-layer coating incorporating SLs showed enhanced hydrophilicity in contact angle measurement that was around 31˚. The contact angle of double-coated substrates was around 39.5˚.FTIR spectra represented the characteristic bands of SLs and PDA on the PDMS surface. A strong band at 1069 cm-1 was attributed to C-O in sugar part of lactonic SLs, and a band at 1458 cm-1 represented the amide in PDA. Biofilm formation was inhibited moderately on PDMS with PDA-SLs coating. A reduction of 1.25-Log and 1.5-Log of mono and double-layer coating was shown, respectively. There was a slight difference when two incubation periods included 3 h and 24 h were tested. Both assays of MTT and propidium iodide showed a good safety profile of PDMS with PDA and SLs coating. No cytotoxic effect was shown for both applied coatings in cytocompatibility assays.
Descrição
Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2020, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.
Palavras-chave
Infections Catheters Silicone Rhamnolipids Antibiofilm Chemical etching Polydopamine Teses de mestrado -2020