Regulation of LDLR expression in breast cancer cells and its implication in tumour progression

Abstract

A progressão tumoral é um fenómeno complexo influenciado por vários fatores intrínsecos e extrínsecos às próprias células tumorais. Uma característica particular das células tumorais é o facto de terem a capacidade de alterar o seu metabolismo, de modo a sustentar a sua elevada proliferação. O colesterol é um componente essencial da membrana citoplasmática e, como tal, essencial à proliferação celular, sendo que a maioria das células obtém o colesterol de que necessita através da internalização de lipoproteínas de baixa densidade (LDL). A internalização do LDL é feita principalmente por meio de recetores de membrana tais como o recetor de LDL (LDLR). É hoje sabido que alterações ao nível do metabolismo do colesterol, quer a nível celular ou sistémico afeta a progressão tumoral. Em particular, a sobre expressão de LDLR em células de cancro da mama foi recentemente associada a um aumento da progressão tumoral e a um pior prognóstico. Os fatores do microambiente tumoral que poderão levar a um aumento de expressão do LDLR em células de cancro da mama, são, no entanto, desconhecidos. Os mecanismos que regulam a expressão do LDLR foram extensivamente estudados em hepatócitos e fibroblastos, bem como noutras células como as células mesangiais do rim. Neste contexto, foi identificado um mecanismo de loop de feedback negativo pelos níveis de colesterol intracelular bem como mecanismos independentes de esteróis, tais como a sinalização por citocinas e fatores de crescimento. No entanto, a regulação da expressão do LDLR em células do cancro da mama foi, até agora, pouco estudada e a identidade de fatores que podem levar a um aumento da expressão do LDLR nas células tumorais de cancro da mama é maioritariamente desconhecida. O presente trabalho tem, então, como principal objetivo colmatar estas lacunas. Por um lado, estudou-se a regulação da expressão de LDLR pelo colesterol, com o intuito de verificar se o mecanismo de feedback negativo se mantém nestas células, apesar de transformadas. Por outro lado, analisou-se a capacidade de citocinas presentes no microambiente tumoral contribuírem para a regulação da expressão do LDLR. Para tal, foram utilizadas três linhas celulares de cancro da mama suscetíveis a alterações no metabolismo do colesterol: as linhas celulares humanas MDA-231 e MCF-7 e a linha celular de ratinho 4T1. Quanto à regulação da expressão do LDLR pelo colesterol, verificou-se que tanto na linha celular MDA-231, quanto na linha celular MCF-7, existe um mecanismo de feedback negativo. Quanto às citocinas, identificou-se o IFNγ como sendo capaz de induzir um aumento da expressão do LDLR ao nível da proteína, em todas as linhas celulares estudadas. Desta forma, posteriormente, analisou-se a consequência de tal aumento de expressão, bem como o mecanismo através do qual o IFNγ leva a um aumento de expressão do LDLR – estes estudos foram feitos na linha celular MDA-231. Observou-se, então, que o aumento da expressão do LDLR pelo IFNγ levou a um aumento da internalização de colesterol pelas células, uma vez que se observou um aumento de colesterol em células tratadas com IFNγ e LDL quando comparado com células tratadas só com LDL. Mais ainda, este aumento de colesterol é revertido quando a entrada de LDL nas células através do LDLR é inibida por via de um anticorpo específico. Ao nível funcional, podemos verificar que células de cancro da mama expostas simultaneamente a LDL e a IFNγ proliferam tanto como células só expostas a LDL; e mais do que células apenas expostas a IFNγ. Uma vez que o IFNγ, por si só, diminui a proliferação das células tumorais, deduzimos que o efeito na presença de ambas as moléculas se deva ao efeito do IFNγ na internalização de LDL por parte das células tumorais. No entanto, uma experiência com o bloqueio do LDLR teria que ser efetuada para comprovar se esse efeito se deve, efetivamente, ao aumento da expressão de LDLR. Do ponto de vista da migração, uma vez que tanto o LDL como o IFNγ provocam um aumento da capacidade migratória destas células, nenhuma conclusão maior pode ser retirada. Do ponto de vista mecanístico, verificou-se que o IFNγ está a atuar nestas células essencialmente ao nível da via JAK / STAT1 que influencia a expressão do LDLR. Mais ainda, os nossos dados sugerem que o IFNγ está a influenciar a expressão do LDLR ao nível da transcrição do gene. In vivo, fomos capazes de demonstrar, em tumores de ratinho, que a localização do LDLR é heterogénia, seria interessante no futuro verificar se as zonas com maior expressão estão associadas a zonas de exposição elevada a IFNγ. Tomados em conjunto, os dados presentes neste trabalho contribuem para uma melhor compreensão de como a internalização do colesterol é regulada em células do cancro da mama, bem como as suas consequências para a progressão tumoral. Mais ainda, acresce com conhecimento novo sobre a ação das citocinas imunomoduladoras presentes no microambiente tumoral. Acreditamos que este conhecimento venha a contribuir para melhorar a capacidade de prevenir, diagnosticar e combater o cancro da mama.

Tumour progression is a complex process that is influenced by both tumour cell intrinsic and extrinsic factors. A particular feature of cancer cells is the ability to alter their metabolism in order to sustain proliferation. Cholesterol is an essential component of cellular membranes and as such essential for proliferative cells and cells all over the body acquire the cholesterol they need mainly from the circulating low-density lipoprotein (LDL). The internalization of LDL is mostly done through membrane receptors such as the LDL receptor (LDLR). Alterations at the level of cellular or systemic cholesterol metabolism have been shown to influence tumour progression. LDLR overexpression, in particular, was recently associated with breast cancer progression and worse prognostic. The most studied and best known way of regulating LDLR expression in cells is through a negative feedback loop induced by intracellular cholesterol levels. This has been mainly shown in hepatocytes and fibroblasts and also in other cell types such as smooth vascular muscle cells, liver cells and mesangial cells. Sterol-independent regulation of LDLR expression, including trough cytokines has also been described in non-malignant cells. Whether breast cancer cells maintain an intact negative feedback loop when exposed to external cholesterol and whether other factors apart from cholesterol regulate LDLR expression in such cells is mainly unknown. The present project aims at analysing the regulation of LDLR by LDL on breast cancer cells and also on testing the hypothesis that there are, at the tumour microenvironment, cytokines able of inducing LDLR expression on breast cancer cells. In order to detect differences in LDLR expression, three breast cancer cell lines susceptible to changes in cholesterol metabolism were used, the MDA-231 and MCF-7 human cell lines and the 4T1 mouse cell line. First of all, we were able to show that both the MDA-231 and the MCF-7 cell line downregulate its LDLR expression when in the presence of high LDL concentrations in the media, demonstrating that they have a functional negative feedback loop mechanism for cholesterol homeostasis. Moreover, we were able to show that IFNγ induces LDLR expression in all cell lines studied. Therefore, this cytokine was chosen for the consequent experiments, which were then performed only on the MDA-231 cell line. Mechanistically, our data suggest that IFNγ is signalling on these cells mainly through the JACK/STAT1 pathway and that inhibiting STAT1 phosphorylation rescues the effect of IFNγ on LDLR expression. Functionally, we show that the increase in LDLR expression by IFNγ led to an increase in the cholesterol uptake in the cells and it seems to induce resistance to IFNγ-induced proliferation arrest. Taken together, we believe that our data will contribute to further characterize how cholesterol metabolism is regulated in breast cancer cells and also increase our knowledge about the action of TME immunomodulatory cytokines, leading to potential new strategies for better preventing, predicting and treating breast cancer in patients.