Modeling neuropathological type II Gaucher Disease using iPSCs, CRISPR/Cas9 and transcription factor-driven protocols

Abstract

A Doença de Gaucher (GD) é uma patologia com transmissão hereditária autossómica recessiva causada por mutações no gene GBA1 que codifica para o enzima beta-glucocerebrosidase (GCase). Esta proteína é um enzima housekeeping nos lisossomas, responsável pela degradação de glucocerebrosidase em glicose e ceramida. Com uma incidência entre 1 em 40.000 e 1 em 60.000 nascimentos na população geral, e 1 em 800 nascimentos na população de descendência Judaica Ashkenazi, é a forma mais comum de Doença Lisossomal de Sobrecarga. Estão descritas mais de 495 mutações no gene GBA1, sendo as mais comuns mutações missense que levam à produção de proteínas misfolded. Em homozigotia ou em heterozigotia composta, certas mutações levam à manifestação de fenótipos mais severos com envolvimento neurológico, em que a atividade da GCase é quase nula, classificado como GD do tipo 2. Independentemente do nível de manifestação da doença, as mutações no gene GBA1 estão associadas a um maior risco de desenvolvimento de Doença de Parkinson e Demência de Corpos de Lewy, através de mecanismos ainda desconhecidos, mas muito provavelmente relacionados com a degradação ineficiente de proteínas, nomeadamente α-sinucleína, em células com funcionamento lisossomal comprometido. Modelos animais têm sido gerados para o estudo de GD, e, embora bastante úteis para as manifestações somáticas desta patologia, o envolvimento neurológico tem sido muito limitado nestes modelos e as mutações induzidas em homozigotia levam a fenótipos agressivos em que os animais não sobrevivem muito tempo após o nascimento, pelo que a sua aplicação no contexto de GD do tipo 2 é bastante insuficiente. Neste sentido, as iPSCs produzidas através da reprogramação direta de células somáticas humanas obtidas de pacientes, a um estadio de pluripotência via o método desenvolvido por Yamanaka, et al, surgem como um possível modelo in vitro, possibilitando o estudo de diversas patologias. Através de métodos de edição genética como CRISPR/Cas9 e da sua otimização nos últimos anos, é possível a introdução, deleção ou correção de mutações nestes modelos celulares, de forma a replicar doenças hereditárias ou obter controlos isogénicos que permitem o seu estudo de forma fidedigna. Inicialmente neste projeto, caracterizámos células iPSCs provenientes de três pacientes com a forma mais severa e com manifestações neuropáticas de GD tipo 2. Através de RT-qPRC, da formação de corpos embrionários e cariotipagem, demonstrámos a estabilidade cromossómica nas amostras em estudo e o seu estado de pluripotência através da expressão de genes como NANOG, SOX2 e OCT4 (POU5F1), bem como a posterior diferenciação dos corpos embrionários nos três folhetos germinativos: endoderme, mesoderme e ectoderme. Seguidamente, trabalhámos na otimização de protocolos de edição genética com CRISPR/Cas9 com o intuito de corrigir as mutações missense de substituição de bases no gene GBA1 das amostras em estudo, de forma a obter controlos isogénicos e, através da sobre-expressão de fatores de transcrição, induzimos a diferenciação das iPSCs em neurónios e astrócitos. Finalmente, demonstrámos níveis significativamente reduzidos de atividade enzimática da GCase nas linhas mutadas e alteração do funcionamento dos lisossomas, quando comparadas a controlos wild type e ao controlo isogénico e função lisossomal alterada, nas amostras de GD tipo 2. De uma forma geral, este estudo demonstrou o potencial significativo da utilização de células iPSCs como modelos in vitro de GD, particularmente da forma neuropática, em que a obtenção dos tipos celulares afetados é particularmente difícil e não existem, até à data desta dissertação, modelos animais que repliquem este fenótipo.

Gaucher Disease (GD) is an autosomal recessive disorder caused by mutations in the GBA1 gene. This gene encodes for the beta-glucocerebrosidase (GCase) protein, a lysosome housekeeping enzyme that degrades the glucocerebroside into glucose and ceramide. With an incidence of 1 in 40,000 to 1 in 60,000 births in the general population, and 1 in 800 births in the Ashkenazi Jewish population, it is the most common type of Lysosomal Storage Disease (LSD). GBA1 mutations are associated with a higher risk of Parkinson's Disease and Lewy body dementia development, through mechanisms still unknown but likely to be related to compromised α-synuclein degradation by cells with impaired lysosomal function. During this project, we have initially characterized iPSCs from three patients with the most severe and neuropathic form of GD, type 2. We have further produced embryoid body formation and induced differentiation to the three germ layers endoderm, mesoderm and ectoderm; and performed RT-qPCR for pluripotency genes in order to demonstrate the pluripotent state of each cell line. Then, we have attempted to optimize CRISP/Cas9 genetic editing protocols and correct the single-base mutations in the GBA1 gene responsible for the manifestations of GD in these patients, with the intent of obtaining isogenic controls for each cell line and, through the overexpression of transcription factors, we were able to induce the differentiation of the iPSCs to neurons and astrocytes. Finally, we have showed significantly reduced levels of GCase activity in the diseased cell lines, though enzymatic activity essays and altered lysosomal function through immunocytochemistry, when compared to GBA1 wild-type controls. Overall this project has allowed to showcase the significant potential of using iPSCs as both a source of relevant cell types and their future application as in vitro models for the study of GD, particularly neuropathic GD, where the cell types affected are particularly challenging to obtain.