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Publicação
Identification of novel glycosylation patterns in cancer and their role in cancer progression and metastasis
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Orientador(es)
Resumo(s)
A Glicosilação consiste na adição enzimática que glicanos a estruturas não glicídicas, como as proteínas ou os lípidos, onde estão envolvidas enzimas como as glicosiltransferases e as glicosidases. É uma das principais modificações pós-traducionais nos eucariotas, ocorre ao longo da via Reticulo Endoplasmático-cis/trans Golgi e consiste num processo altamente regulado de onde resulta uma extensa diversidade de glicoconjugados. A esta grande diversidade está subjacente uma grande variedade de glicanos que resulta dos diferentes arranjos de açúcares e das diferentes ligações que estabelecem entre si para formar estruturas ramificadas e mais complexas. Existem vários tipos de glicosilação, no entanto, nas proteínas, a N e a O-glicosilação são os mais comuns. Estes dois processos diferem essencialmente no local de ligação à proteína, isto é, no aminoácido ao qual irá ficar ancorado o glicano, e no processamento das estruturas ramificadas. Cada célula ou tecido, bem como diferentes estágios do desenvolvimento celular, têm uma identidade própria no que se refere aos glicanos que são produzidos. Por sua vez, os glicanos desempenham diversas funções nos mais diversos processos biológicos. Por exemplo, existem glicoproteínas, ou seja, proteínas às quais estão ligados glicanos, com funções fundamentais ao nível do reconhecimento celular, da adesão, da sinalização e até mesmo do próprio folding. Uma proteína pode transportar mais do que um padrão de glicosilação. Tendo em conta a enorme importância dos glicanos nas funções biológicas, é natural que alterações nos processos de glicosilação sejam responsáveis por comprometer o correto funcionamento dessas mesmas funções ao nível celular, o que muitas das vezes resulta, por exemplo, em defeitos ao nível da adesão celular, com comprometimento da homeostase e do funcionamento dos tecidos. Assim sendo, a expressão de padrões de glicosilação aberrantes está associada ao cancro e é responsável por um aumento da sua malignidade, o que se traduz num rápido avanço na progressão tumoral e na formação de metástases, a principal causa de morte em cancro. Desta forma, defeitos nos padrões de glicosilação estão relacionados com um mau prognóstico em diversos tipos de cancro, entre eles, o cancro de colon, mama e pulmão. Um dos padrões de glicosilação fortemente associado ao aumento da malignidade tumoral e da metástase é o sialil-Lewis x/a, na maioria das vezes ancorado a glicoproteínas que também desempenham um papel fundamental na progressão tumoral. Por exemplo, a Mucina 1, cuja expressão aumentada e a sua glicosilação alterada, têm sido reportadas em vários tipos de cancro, em especial, no cancro de colon e no cancro da mama. O sialil-Lewis x/a é ainda fundamental no reconhecimento da E-seletina, uma glicoproteína transmembranar muito glicosilada com funções de adesão, cuja expressão é fortemente influenciada pelos indicadores de inflamação, como por exemplo citocinas pró-inflamatórias, entre as quais a IL-1β. A grande maioria dos ligandos de E-seletina expressam este glicano sialofucosilado que, ao reconhecer a E-seletina expressa nas células endoteliais, diminuem o rolamento das células tumorais, aumentam a sua adesão dando-se início à invasão dos tecidos por essas células. A fucose é fundamental neste processo de reconhecimento, bem como os aminoácidos adjacentes e a presença de cálcio. Neste processo estão também envolvidos outros fatores, como por exemplo, os fatores angiogénicos que induzem a proliferação das células endoteliais e o aumento da permeabilidade endotelial, facilitando a entrada, nos tecidos, das células tumorais em circulação. Também na transição epitélio-mesenquima estes padrões de glicosilação parecem desempenhar um papel importante. Este processo consiste num programa celular e molecular em que as células epiteliais vão progressivamente diminuindo a expressão dos seus marcadores epiteliais, como as citoqueratinas e as E-caderinas, e aumentando a expressão dos seus marcadores mesenquimas, nomeadamente, a fibronectina e a vimentina. Assim sendo, as células vão progressivamente perdendo a adesão, descolam-se das massas tumorais primárias e entram em circulação. Por conseguinte, a expressão aumentada de ligandos de E-seletina, bem como de sialil-Lewis x/a, está relacionada com o aumento da progressão tumoral, nomeadamente, da invasão e da metástase. O estudo destes padrões de glicosilação aberrante é fundamental uma vez que estão associados a uma maior malignidade, a um mau prognóstico e, por conseguinte, a uma menor sobrevivência em cancro. Nesta tese, temos como principais objetivos avaliar a expressão de padrões de glicosilação aberrante em tecidos de cancro, identificando novos biomarcadores como potenciais alvos terapêuticos, nomeadamente candidatos a proteínas scaffold que transportem esses padrões de glicosilação, e ainda, avaliar esses padrões em modelos experimentais, designadamente em linhas celulares, de forma a compreender a função desses glicanos, bem como da fucosilação, na progressão tumoral e na metástase. Identificámos estes padrões de glicosilação expressos em tecidos de cancro de colon e de cancro de mama, e através dos ensaios nas linhas celulares, mostrámos que a inibição da fucosilação, utilizando o inibidor 2-fluorofucose, é responsável por diminuir a expressão dos mRNAs das fucosiltransferases (FUT II, FUT IV, FUT V, FUT X e FUT XI) envolvidas na síntese dos antigénios de Lewis, bem como dos próprios ligandos sialofucosilados, como o sialil-Lewis x/a, que revestem glicoproteínas importantes, do ponto de vista funcional, entre as quais a Mucina 1, que também mostrámos estar expressa em tecidos tumorais e com padrões de glicosilação aberrante associados. Mais ainda, esta diminuição parece interferir com os componentes estruturais do citoesqueleto, nomeadamente, as citoqueratinas, que fazem parte dos filamentos intermédios, e cuja expressão, não só é aumentada, como o padrão de expressão é diferente em diferentes linhas celulares de cancro, sugerindo que a fucosilação afeta de forma diferente, diferentes citoqueratinas, confirmando que estas proteínas são uteis como biomarcadores que permitem caracterizar células e estágios tumorais. Relativamente à Mucina 1, verificámos que a inibição da fucosilação aumenta a expressão da sua forma sub-glicosilada que por sua vez fica retida no citosol, confirmando o papel da fucosilação no transporte para a membrana e reforçando uma possível função da Mucina 1 ao nível das vias de sinalização intracelular. Além disso, a inibição da fucosilação foi também responsável por diminuir a expressão de fibronectina, um importante componente da matriz extracelular, com funções em processos fundamentais em cancro como a transição epitélio-mesenquima. A fibronectina é um marcador mesenquimal cuja expressão fica diminuída, enquanto que as citoqueratinas, um marcador epitelial, aumentam a sua expressão em resposta à inibição da fucosilação. Desta forma, a inibição da fucosilação parece ser capaz de retardar a entrada das células tumorais no programa de transição epitélio-mesenquima. Estas alterações fenotípicas são capazes de diminuir a capacidade proliferativa e a migração das células tumorais, bem como atuar ao nível das vias de sinalização através da modelação, por um lado, da expressão de fatores de crescimento envolvidos na progressão do ciclo celular, no crescimento tumoral, na angiogénese e na invasão, como os fatores TGF-β (Transforming Growth Factor β), FGF2 (Fibroblast Growth Factor 2) e VEGF-A (Vascular Endothelial Grwoth Factor A), e por outro, na expressão de citocinas pró-inflamatórias, entre as quais a IL-1β e a IL-6. Ou seja, o contexto ao nível do microambiente tumoral é alterado, por consequência do tratamento com o inibidor de fucosilação, o que tem implicações em duas das principais características das células tumorais, a proliferação e a migração, e por conseguinte, na progressão tumoral e na metástase. No conjunto, os nossos resultados, além de confirmarem a importância dos ligandos de E-seletina ao longo do desenvolvimento tumoral, sugerem que a inibição da fucosilação, além de diminuir a expressão de padrões de glicosilação aberrantes, neste caso o sialil-Lewis x/a, é capaz de induzir um conjunto de alterações morfológicas e fenotípicas, nomeadamente ao nível das citoqueratinas, da fibronectina e da Mucina1, que poderão conduzir ao restauro de um fenótipo menos agressivo no que diz respeito ao desenvolvimento tumoral, nomeadamente a invasão e a metastização tumorais, ou seja, é capaz de retardar a progressão tumoral. Uma melhor compreensão destas características e propriedades poderão vir a ser exploradas no estudo e no desenvolvimento de novas terapias que tenham como alvo terapêutico as fazes iniciais da metastização, como a transição epitélio-mesenquima, e a fucosilação.
Aberrant glycosylation patterns are responsible for a significant increase in tumour malignancy. It is increasingly evident that such patterns play an important role in cancer progression, namely in invasion and metastasis, which is related to poor prognosis in cancer. The expression of sialofucosylated glycans, such as sialyl-Lewis x and sialyl-Lewis a (sLex/a), by circulation tumour cells, seems to be essential and able to promote extravasation and tissues invasion, a crucial step in metastasis. In this thesis, we aimed to identify the expression of aberrant glycosylation patterns, namely the sLex/a antigens, in colon adenocarcinoma and TNBC tissues, using the immunohistochemical method, and then, using cell lines as experimental model, we have attempted to study the role of these patterns, through the inhibition of fucosylation, in cancer progression and metastasis. Our results show that inhibition of fucosylation, using 2-fluorofucose inhibitor, is responsible for decreasing the expression of sialofucosylated ligands, such as the minimal determinant for E-selectin binding, the sLex/a, which is expressed in tumour tissues and decorate functionally important glycoproteins, being the Mucin 1 a candidate to carry this glycosylation pattern. Immunofluorescence assays show that this decrease seems to interfere with the cytoskeleton components, namely the cytokeratins, whose expression is increased. In addition, inhibition of fucosylation was also responsible for decreasing the expression of fibronectin, an important component of the extracellular matrix with functions in fundamental processes in cancer, such as the epithelial-mesenchymal transition. These phenotypic alterations can decrease the proliferative capacity and tumour cells migration, as well as, interfere with signalling pathways by modelling the expression of growth factors involved in the cell cycle progression, tumour growth, angiogenesis and invasion, as well as proinflammatory cytokines, including IL-1β and IL-6, whose expression was assessed by RT-qPCR. Our results also suggest that the inhibition of fucosylation, besides reducing the expression of aberrant glycosylation patterns, can induce a set of morphological and phenotypic alterations that may lead to the restoring of a less aggressive phenotype considering invasion and cancer metastasis. These features may be explored in the future to the study and development of new therapies that target the initial stages of metastasis, like the epithelial-mesenchymal transition, and fucosylation.
Aberrant glycosylation patterns are responsible for a significant increase in tumour malignancy. It is increasingly evident that such patterns play an important role in cancer progression, namely in invasion and metastasis, which is related to poor prognosis in cancer. The expression of sialofucosylated glycans, such as sialyl-Lewis x and sialyl-Lewis a (sLex/a), by circulation tumour cells, seems to be essential and able to promote extravasation and tissues invasion, a crucial step in metastasis. In this thesis, we aimed to identify the expression of aberrant glycosylation patterns, namely the sLex/a antigens, in colon adenocarcinoma and TNBC tissues, using the immunohistochemical method, and then, using cell lines as experimental model, we have attempted to study the role of these patterns, through the inhibition of fucosylation, in cancer progression and metastasis. Our results show that inhibition of fucosylation, using 2-fluorofucose inhibitor, is responsible for decreasing the expression of sialofucosylated ligands, such as the minimal determinant for E-selectin binding, the sLex/a, which is expressed in tumour tissues and decorate functionally important glycoproteins, being the Mucin 1 a candidate to carry this glycosylation pattern. Immunofluorescence assays show that this decrease seems to interfere with the cytoskeleton components, namely the cytokeratins, whose expression is increased. In addition, inhibition of fucosylation was also responsible for decreasing the expression of fibronectin, an important component of the extracellular matrix with functions in fundamental processes in cancer, such as the epithelial-mesenchymal transition. These phenotypic alterations can decrease the proliferative capacity and tumour cells migration, as well as, interfere with signalling pathways by modelling the expression of growth factors involved in the cell cycle progression, tumour growth, angiogenesis and invasion, as well as proinflammatory cytokines, including IL-1β and IL-6, whose expression was assessed by RT-qPCR. Our results also suggest that the inhibition of fucosylation, besides reducing the expression of aberrant glycosylation patterns, can induce a set of morphological and phenotypic alterations that may lead to the restoring of a less aggressive phenotype considering invasion and cancer metastasis. These features may be explored in the future to the study and development of new therapies that target the initial stages of metastasis, like the epithelial-mesenchymal transition, and fucosylation.
Descrição
Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, em 2018
Palavras-chave
Fucosilação Cancro sLex/a EMT Metástase Teses de mestrado - 2018