A carregar...
Publicação
Functional impact of specific miRNAs on γδ T cell development
| Nome: | Descrição: | Tamanho: | Formato: | |
|---|---|---|---|---|
| 3.37 MB | Adobe PDF |
Autores
Orientador(es)
Resumo(s)
O sistema imune é composto por uma variedade de moléculas e células efetoras que protegem o organismo do potencial dano causado por agentes infecciosos e pelas suas toxinas. Entre os vários componentes do sistema imune, os linfócitos apresentam o maior potencial no reconhecimento e destruição de microorganismos e são parte integral da imunidade adaptativa, sendo dotados da especificidade e memória imunológica que lhe são características. Os linfócitos T em particular são responsáveis pela imunidade celular, participando nomeadamente na resposta contra células infectadas ou cancerígenas. Dentro destes, as células T γδ constituem uma população conservada, crucial na produção de citocinas pró-inflamatórias em contextos de (pato)fisiologia, tais como a infecção e o cancro mas também em autoimunidade e homeostase. As células T γδ são pré-programadas no timo em dois subtipos que se distinguem pela produção de interleucina (IL)-17 ou interferão (IFN)-γ, segregados pela expressão do marcador de superfície CD27, e a sua migração do timo para órgãos linfoides e outros tecidos específicos como a derme tem início em ondas de subpopulações distintas ainda na vida embrionária Enquanto as células T γδ produtoras de IFN-γ são essenciais na resposta a infecções intracelulares, como Listeria monocytogenes, as células T γδ produtoras de IL-17 participam na resposta a patogénios extracelulares, como Staphylococcus aureus e Candida albicans. Adicionalmente ao seu papel protetor, estas duas
subpopulações participam também em doenças autoimunes, como a esclerose múltipla ou a
psoríase. Embora ainda não se conheçam os mecanismos subjacentes à pré-programação da
função efetora de células T γδ no timo, estes estão na base da sua participação não-redundante na resposta inflamatória, especialmente na fase inicial, uma vez que lhes permite uma rápida secreção de citocinas após ativação por um estímulo. Os microRNAs (miRNAs) são pequenas moléculas de RNA transcritos a partir do genoma cuja forma madura resulta do processamento pela maquinaria celular no núcleo e no citoplasma. Esta classe de moléculas de RNA não codificante silencia a expressão de genes alvo após emparelhamento com a região 3’ UTR do respetivo RNA mensageiro (mRNA), promovendo a desestabilização dos transcritos ou a inibição da sua tradução. Como um miRNA pode interagir com vários mRNAs e levar à sua inibição, estima-se que mais de metade de todos os genes codificantes de proteínas em mamíferos estejam sujeitos a regulação por miRNAs. A sua contribuição na regulação de redes de expressão génica enquanto reguladores pós-transcricionais tem sido implicada em processos celulares tão fundamentais como a apoptose, o metabolismo, a divisão celular e a diferenciação celular, onde se inclui a diferenciação de linfócitos T. Além da participação crucial em homeostase, a desregulação dos níveis de expressão de miRNAs específicos em determinados tipos celulares tem sido associada a diversas condições patológicas, como as doenças autoimunes e o cancro. Embora vários miRNAs tenham até ao momento sido implicados no controlo da diferenciação e função de muitos tipos de células do sistema imune, nomeadamente na regulação da produção de IFN-γ e IL-17 por outros linfócitos T, pouco se sabe sobre o seu papel nas células T γδ. O nosso grupo descreveu pela primeira vez o papel de um miRNA na regulação da função efetora e plasticidade das células T γδ. Demonstrou-se que as células T γδ CD27-, que geralmente expressam IL-17 mas cuja co-expressão de IFN-γ pode ser induzida em condições inflamatórias como o microambiente tumoral, expressam seletivamente o miR-146a, que inibe a sua produção de IFN-γ através da sua ligação específica à região 3’ UTR do mRNA-alvo Nod1. Tendo em vista o estudo detalhado da regulação da diferenciação de células T γδ efetoras por miRNAs, explorámos uma estratégia independente do uso de marcadores de superfície, que não permitem o isolamento de populações puras de células T γδ produtoras de IL-17 ou IFN-γ. Assim, recorreu-se a uma estirpe de murganho duplo repórter para IL-17 (GFP) e IFN-γ (YFP), a partir da qual foram isoladas populações puras de células T γδ produtoras de IL-17 ou IFN-γ dos órgãos linfóides periféricos tendo os repertórios de miRNA e mRNA sido analisados por NGS “next-generation-sequencing”. Os miRNAs e mRNAs diferencialmente expressos nas duas populações foram integrados bioinformaticamente em redes que permitiram a previsão de 6 miRNAs - miR-7a-5p, miR-92a-1-5p, miR-128-3p, miR-139-5p, miR-677-3p and miR-1949 que reprimem o programa de expressão de IL-17 e 3 miRNAs - miR-322-5p, miR-326-3p and miR-450b-3p – que reprimem o programa de produção de IFN-γ das células T γδ por interação com mRNAs-chave das suas redes de expressão génica. O objectivo desta tese consistiu em analisar os potenciais efeitos destes miRNAs no desenvolvimento das células T γδ em termos da pré-programação no timo conducente à expressão de IL-17 ou IFN-γ. Confirmou-se que os miRNAs previamente selecionados a partir de células T γδ da periferia seguem o mesmo padrão de expressão diferencial nas populações correspondentes de células T γδ no timo fetal pré-programadas para a expressão de IL-17 ou IFN-γ, sugerindo que as assinaturas observadas na periferia são estabelecidas ainda durante o seu desenvolvimento no timo. De seguida, com vista à modulação funcional dos níveis dos miRNAs candidatos, procedeu-se à sua clonagem em retrovírus e estabeleceu-se um modelo de desenvolvimento de células T γδ que permite a modelação dos seus níveis de expressão através da transdução de células progenitoras de fígado fetal em co-cultura com células estromais OP9-DL1. Dado que, mesmo após uma extensa optimização em termos de combinações de citocinas adicionadas em pontos diferentes das co-culturas, não se conseguiram obter células T γδ produtoras de IL-17, que poderá ser uma limitação do sistema, as análises subsequentes foram focadas nos miRNAs envolvidos no programa de expressão de IFN-γ. A sua sobre-expressão nos progenitores em co-cultura com células OP9-DL1 mostrou que o miR-326 e o miR-450b regulam potencialmente o desenvolvimento de células T γδ, através da inibição da produção de IFN-γ. De acordo com esta observação, os níveis de expressão ex vivo de ambos os miRNAs aumentam especificamente em células que no timo fetal entram na via de expressão de IL-17 mas não em células que iniciam a pré-programação para produção de IFN-γ, sugerindo que, à semelhança do miR-146a, tanto o miR-326 como o miR-450b podem diminuir a plasticidade de células T γδ produtoras de IL-17, reprimindo a co-expressão de IFN-γ e mantendo a sua identidade celular. Mecanisticamente, previu-se que o miR-450b inibisse diretamente o mRNA do IFN-γ ligando-se à sua região 3’ UTR, enquanto o miR-326 inibiria os mRNAs codificantes de três proteínas associadas à produção de IFN-γ, o marcador extracelular CD27 e oa factores de transcrição Egr2 e Eomesodermin (Eomes). Experiências futuras incidirão numa caracterização funcional mais abrangente do efeito dos miRNAs na identidade e função das células T efectoras, bem como na modelação selectiva da produção de IL-17 e IFN-γ por células T γδ pela manipulação dos níveis de miRNAs. Os resultados obtidos poderão revelar interesse terapêutico em patologias associadas não só à desregulação da expressão de miRNAs nestas células mas também à desregulação da sua produção de citocinas. No seu conjunto, os dados descritos nesta tese confirmam a importância da pré-programação que ocorre no timo durante o desenvolvimento de células T γδ e a manutenção da sua assinatura genética na periferia, e revelam dois novos miRNAs que desempenham um papel na regulação da pré-programação funcional de células T γδ, contribuindo para o conhecimento dos mecanismos epigenéticos subjacentes ao controlo da sua função efetora.
γδ T cells are key providers of proinflammatory cytokines in various contexts of (patho)physiology. They are pre-programmed in the thymus into distinct subsets producing either interleukin-17 (IL-17) or interferon-γ (IFN-γ), which segregate with CD27 expression. In the periphery, CD27− γδ T cells, which usually express IL-17, can be induced to coexpress IL-17 and IFN-γ under highly inflammatory conditions. We have previously found that miR-146a was selectively enriched in these cells and restricted their IFN-γ production by targeting Nod1 mRNA. In this project we aimed at further dissecting microRNA (miRNA)-mediated regulation of effector γδ T cell differentiation independently of the use of surface markers, which do not allow the isolation of pure populations of IL-17+ or IFN-γ+ γδ T cells. Instead, such pure γδ T cell populations were isolated from the peripheral lymphoid organs of a double reporter IL-17-GFP:IFN-γ-YFP mouse strain and subjected to next generation sequencing analysis of both microRNA and mRNA repertoires, which allowed for the first time the identification of miRNA and mRNA signatures directly associated with cytokine expression. Differentially expressed miRNAs and mRNAs were bioinformatically integrated into networks that allowed the prediction of respectively 6 and 3 miRNAs targeting key determinants of the IL-17 and IFN-γ programs of γδ T cells. In this work, we have validated by real-time quantitative PCR the expression pattern of these miRNAs in the corresponding foetal thymic γδ T cell subsets. Gain-of-function studies based on retroviral transduction of foetal liver progenitor cells co-cultured on OP9-DL1 stromal cells indicated that miR-326 and miR-450b regulate γδ T cell development, namely by inhibiting IFN-γ production. Moreover, both miRNAs levels specifically increased in γδ T cells that pre-commit to the IL-17 pathway but not to the IFN-γ pathway. Overall, by revealing two novel miRNAs with a role in γδ T cell thymic pre-commitment, the data described here support the importance of the thymic pre-programming of γδ T cell development and adds to the epigenetic knowledge of the regulation of γδ T cell effector function.
γδ T cells are key providers of proinflammatory cytokines in various contexts of (patho)physiology. They are pre-programmed in the thymus into distinct subsets producing either interleukin-17 (IL-17) or interferon-γ (IFN-γ), which segregate with CD27 expression. In the periphery, CD27− γδ T cells, which usually express IL-17, can be induced to coexpress IL-17 and IFN-γ under highly inflammatory conditions. We have previously found that miR-146a was selectively enriched in these cells and restricted their IFN-γ production by targeting Nod1 mRNA. In this project we aimed at further dissecting microRNA (miRNA)-mediated regulation of effector γδ T cell differentiation independently of the use of surface markers, which do not allow the isolation of pure populations of IL-17+ or IFN-γ+ γδ T cells. Instead, such pure γδ T cell populations were isolated from the peripheral lymphoid organs of a double reporter IL-17-GFP:IFN-γ-YFP mouse strain and subjected to next generation sequencing analysis of both microRNA and mRNA repertoires, which allowed for the first time the identification of miRNA and mRNA signatures directly associated with cytokine expression. Differentially expressed miRNAs and mRNAs were bioinformatically integrated into networks that allowed the prediction of respectively 6 and 3 miRNAs targeting key determinants of the IL-17 and IFN-γ programs of γδ T cells. In this work, we have validated by real-time quantitative PCR the expression pattern of these miRNAs in the corresponding foetal thymic γδ T cell subsets. Gain-of-function studies based on retroviral transduction of foetal liver progenitor cells co-cultured on OP9-DL1 stromal cells indicated that miR-326 and miR-450b regulate γδ T cell development, namely by inhibiting IFN-γ production. Moreover, both miRNAs levels specifically increased in γδ T cells that pre-commit to the IL-17 pathway but not to the IFN-γ pathway. Overall, by revealing two novel miRNAs with a role in γδ T cell thymic pre-commitment, the data described here support the importance of the thymic pre-programming of γδ T cell development and adds to the epigenetic knowledge of the regulation of γδ T cell effector function.
Descrição
Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, em 2018
Palavras-chave
miRNAs Células T γδ Desenvolvimento de linfócitos T Timo Citocinas Teses de mestrado - 2018