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Publicação
Balance between pro-inflammatory/anti-inflammatory indicators of SOD1G93A microglia in steady conditions and modification by immunomodulation
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Orientador(es)
Resumo(s)
Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) is the third most common neurodegenerative disease, mostly sporadic, with limited identified targets, biomarkers and therapeutic options. The most widely used animal model and experimental cellular models to study ALS pathological mechanisms are based on mutations in the anti-oxidant protein SOD1, particularly that of G93A. ALS affects mainly motor neurons, but it is widely accepted that immune unbalance plays a crucial role in the ALS disease, and microglial dysfunction is described to be associated with neuronal injury influencing disease onset and progression. As the immune cells of the central nervous system, microglia produce inflammatory responses towards an insult by secreting pro-inflammatory mediators to the extracellular milieu in the form of soluble factors, or in membrane-bound vesicles called exosomes, an important component in intercellular communication and in disease dissemination. In this thesis we aimed to better understand the role of microglia in ALS disease using the mutant SOD1G93A microglia, and assessing their reactivity upon the immunostimulation by lipopolysaccharide (LPS), and immunomodulation by glycoursodeoxycholic acid (GUDCA) and vinyl sulfone (VS), having in mind the goal of fighting ALS neurodegeneration. For that, we assessed microglia function/dysfunction and reactivity after human SOD1 overexpression in the N9 cell line, either wild type (hSOD1WT) or mutated in G93A (hSOD1G93A), alone or treated with LPS, and when exposed to GUDCA and VS, known for their potential anti-inflammatory effects. Data showed that overexpression of hSOD1WT in N9 cells leads to a decrease in all analyzed pro- and anti-inflammatory markers, whereas hSOD1G93A increases both pro-inflammatory TNF-α, IL-1β, MHCII and HMGB1 gene expression levels, together with anti-inflammatory Arg1 and SOCS1 indicators, and reduces iNOS, Fizz1, IL-10, TLR4, miR-125b and miR-21. Interestingly we found an elevated cargo of miR-155 and miR-146a in hSOD1G93A microglia-derived exosomes. Upon LPS exposure, all cells switched from ramified into amoeboid morphology. LPS-treated transgenic microglia showed equivalent pro-inflammatory markers, when compared to LPS-treated naïve cells. However, they revealed decreased levels of the anti-inflammatory Arg1, Fizz1 and IL-10, thus reducing the ability to later balance the microglia reactivity to the insult. Surprisingly, cells also evidenced reduced miR-155 expression, what may even compromise an adequate pro-inflammatory response. In contrast with hSOD1WT cells, SOD1G93A microglia displayed decreased gene expression of S100B and equal of TNF-α mRNA, when compared to naïve cells. Additionally, the ability of ingesting a high number of beads (≥ 11) was found diminished. Treatment with GUDCA or VS decreased the cell body area of reactive microglia, and SOCS1 and Arg1 mRNA expression. Nevertheless, both immunomodulators increased TLR4, as well as reduced IL-1β and S100B gene expression, which may represent benefits for response to selected insults, while protecting from destructive secondary damage, respectively. In addition, though it decreased cellular MFG-E8 and enhanced miR-125b in exosomes, GUDCA markedly increased the cellular gene expression of the anti-inflammatory IL-10. On the other hand, VS was the only one able to reduce the pro-inflammatory MMP-9 activity and to elevate the exosomal cargo in the anti-inflammatory miR-21. In conclusion, this work demonstrates the advantageous hSOD1WT overexpression in balancing pro- and anti-inflammatory mediators in microglial cells, but overall that upregulation of hSOD1G93A increases their reactivity and may have a detrimental role in reducing their wound repair ability after insult, thus causing homeostatic imbalance between anti-inflammatory and pro-inflammatory gene expression mediators. In addition, the study also highlights that, although with different potential roles, both VS and GUDCA may have benefits over specific hSOD1G93A polarized microglia subtypes.
A Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) é a terceira doença neurodegenerativa mais comum, sendo maioritariamente esporádica, e limitada em termos de alvos, biomarcadores e opções terapêuticas. Os modelos animais e celulares mais usados no estudo dos mecanismos envolvidos na patogénese da ELA consideram mutações na enzima antioxidante SOD1, particularmente, a mutação G93A. A ELA afeta maioritariamente neurónios motores. No entanto, é considerado que existe uma desregulação inflamatória nesta doença que contribui para a sua progressão. A disfunção de células microgliais é associada ao dano neuronal, o que consequentemente leva ao início e progressão da doença. No Sistema Nervoso Central (CNS), as células da microglia são responsáveis pela produção da resposta inflamatória em consequência da presença de moléculas estranhas no ambiente extracelular. Esta resposta baseia-se na secreção de mediadores pro-inflamatórios para o meio extracelular sob a forma de fatores solúveis ou incorporados em vesículas membranares denominadas de exossomas, um importante meio de comunicação intercelular na disseminação da patologia. Na presente tese, pretendeu-se compreender melhor o papel da microglia na ELA, utilizando células da microglia sobreexpressando SOD1G93A, e avaliando a sua reatividade após estimulação com lipopolissacárido (LPS), e após tratamento com os imunomoduladores ácido glicoursodesoxicólico (GUDCA) e vinil sulfona (VS), com o objetivo de combater a neurodegeneração na ELA. Para isso, avaliámos a função/disfunção e reatividade microglial após a sobreexpressão da enzima SOD1 na linha celular N9, na conformação WT (hSOD1WT) ou mutada em G93A (hSOD1G93A) da enzima, em células sem tratamento ou tratadas com LPS. Adicionalmente, avaliámos o potencial anti-inflamatório dos compostos GUDCA e VS nas células sobreexpressando hSOD1G93A. Os nossos resultados demonstraram que a sobreexpressão de hSOD1WT em células N9 leva a uma diminuição de todos os parâmetros pro- e anti-inflamatórios analisados, enquanto que da sobreexpressão de hSOD1G93A leva a um aumento da expressão génica dos marcadores pro-inflamatórios TNF-α, IL-1β, MHCII e HMGB1 em conjunto com os marcadores anti-inflamatórios Arg1 e SOCS1, reduzindo iNOS, Fizz1, IL-10, TLR4, miR-125b e miR-21. Curiosamente, exossomas derivados de microglia sobreexpressando hSOD1G93A revelaram transportar maiores quantidades de miR-155 e miR-146a. Após exposição ao LPS, todas as células modificaram a sua morfologia ramificada para uma forma ameboide. Células N9 hSOD1G93A tratadas com LPS demonstraram marcadores pro-inflamatórios com níveis equivalentes ao das células controlo. No entanto, revelaram também uma diminuição dos marcadores pró-inflamatórios Arg1, Fizz1 e IL-10, reduzindo assim a capacidade da microglia de resposta ao insulto. Surpreendentemente, estas células demonstraram ainda uma diminuição de miR-155, o que pode sugerir uma resposta pró-inflamatória adequada. Ao contrário de células sobreexpressando hSOD1WT, microglia SOD1G93A apresentou uma diminuição nos níveis de expressão génica de S100B e igual expressão de TNF-α quando comparadas ao controlo. Adicionalmente, estas células evidenciaram uma diminuição da capacidade de ingestão de um elevado número de beads [≥11]. O tratamento com GUDCA ou VS demonstrou diminuir a área do corpo celular das células reativas da microglia, em conjunto com uma diminuição da expressão génica de SOCS1 e Arg1. Contudo, ambos os imunomoduladores aumentaram a expressão de TLR4, diminuindo a expressão de IL-1β e S100B, o que pode sugerir o efeito benéfico destes compostos na resposta a insultos, protegendo contra efeitos secundários destrutivos, respetivamente. Adicionalmente, apesar da diminuição da expressão de MFG-E8 e aumento da expressão de miR-125b em exossomas, o composto GUDCA evidenciou um aumento significativo da expressão do marcador anti-inflamatório IL-10. Por outro lado, apenas o tratamento com VS foi bem-sucedido na diminuição da atividade da MMP-9 e aumento do transporte do anti-inflamatório miR-21 em exossomas. Em conclusão, este trabalho demonstra o benefício da sobreexpressão de hSOD1WT no equilíbrio de marcadores pro- e anti-inflamatórios nas células da microglia, enquanto a sobreexpressão de hSOD1G93A aumenta a reatividade microglial, podendo ter um papel prejudicial na redução da sua capacidade de resposta a estímulos externos, causando assim um desequilíbrio na expressão génica de marcadores pro- e anti-inflamatórios. Adicionalmente, este estudo foca ainda que, apesar de com diferentes funções, os compostos GUDCA e a VS que podem ser benéficos para as células da microglia hSOD1G93A com diferentes polarizações.
A Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) é a terceira doença neurodegenerativa mais comum, sendo maioritariamente esporádica, e limitada em termos de alvos, biomarcadores e opções terapêuticas. Os modelos animais e celulares mais usados no estudo dos mecanismos envolvidos na patogénese da ELA consideram mutações na enzima antioxidante SOD1, particularmente, a mutação G93A. A ELA afeta maioritariamente neurónios motores. No entanto, é considerado que existe uma desregulação inflamatória nesta doença que contribui para a sua progressão. A disfunção de células microgliais é associada ao dano neuronal, o que consequentemente leva ao início e progressão da doença. No Sistema Nervoso Central (CNS), as células da microglia são responsáveis pela produção da resposta inflamatória em consequência da presença de moléculas estranhas no ambiente extracelular. Esta resposta baseia-se na secreção de mediadores pro-inflamatórios para o meio extracelular sob a forma de fatores solúveis ou incorporados em vesículas membranares denominadas de exossomas, um importante meio de comunicação intercelular na disseminação da patologia. Na presente tese, pretendeu-se compreender melhor o papel da microglia na ELA, utilizando células da microglia sobreexpressando SOD1G93A, e avaliando a sua reatividade após estimulação com lipopolissacárido (LPS), e após tratamento com os imunomoduladores ácido glicoursodesoxicólico (GUDCA) e vinil sulfona (VS), com o objetivo de combater a neurodegeneração na ELA. Para isso, avaliámos a função/disfunção e reatividade microglial após a sobreexpressão da enzima SOD1 na linha celular N9, na conformação WT (hSOD1WT) ou mutada em G93A (hSOD1G93A) da enzima, em células sem tratamento ou tratadas com LPS. Adicionalmente, avaliámos o potencial anti-inflamatório dos compostos GUDCA e VS nas células sobreexpressando hSOD1G93A. Os nossos resultados demonstraram que a sobreexpressão de hSOD1WT em células N9 leva a uma diminuição de todos os parâmetros pro- e anti-inflamatórios analisados, enquanto que da sobreexpressão de hSOD1G93A leva a um aumento da expressão génica dos marcadores pro-inflamatórios TNF-α, IL-1β, MHCII e HMGB1 em conjunto com os marcadores anti-inflamatórios Arg1 e SOCS1, reduzindo iNOS, Fizz1, IL-10, TLR4, miR-125b e miR-21. Curiosamente, exossomas derivados de microglia sobreexpressando hSOD1G93A revelaram transportar maiores quantidades de miR-155 e miR-146a. Após exposição ao LPS, todas as células modificaram a sua morfologia ramificada para uma forma ameboide. Células N9 hSOD1G93A tratadas com LPS demonstraram marcadores pro-inflamatórios com níveis equivalentes ao das células controlo. No entanto, revelaram também uma diminuição dos marcadores pró-inflamatórios Arg1, Fizz1 e IL-10, reduzindo assim a capacidade da microglia de resposta ao insulto. Surpreendentemente, estas células demonstraram ainda uma diminuição de miR-155, o que pode sugerir uma resposta pró-inflamatória adequada. Ao contrário de células sobreexpressando hSOD1WT, microglia SOD1G93A apresentou uma diminuição nos níveis de expressão génica de S100B e igual expressão de TNF-α quando comparadas ao controlo. Adicionalmente, estas células evidenciaram uma diminuição da capacidade de ingestão de um elevado número de beads [≥11]. O tratamento com GUDCA ou VS demonstrou diminuir a área do corpo celular das células reativas da microglia, em conjunto com uma diminuição da expressão génica de SOCS1 e Arg1. Contudo, ambos os imunomoduladores aumentaram a expressão de TLR4, diminuindo a expressão de IL-1β e S100B, o que pode sugerir o efeito benéfico destes compostos na resposta a insultos, protegendo contra efeitos secundários destrutivos, respetivamente. Adicionalmente, apesar da diminuição da expressão de MFG-E8 e aumento da expressão de miR-125b em exossomas, o composto GUDCA evidenciou um aumento significativo da expressão do marcador anti-inflamatório IL-10. Por outro lado, apenas o tratamento com VS foi bem-sucedido na diminuição da atividade da MMP-9 e aumento do transporte do anti-inflamatório miR-21 em exossomas. Em conclusão, este trabalho demonstra o benefício da sobreexpressão de hSOD1WT no equilíbrio de marcadores pro- e anti-inflamatórios nas células da microglia, enquanto a sobreexpressão de hSOD1G93A aumenta a reatividade microglial, podendo ter um papel prejudicial na redução da sua capacidade de resposta a estímulos externos, causando assim um desequilíbrio na expressão génica de marcadores pro- e anti-inflamatórios. Adicionalmente, este estudo foca ainda que, apesar de com diferentes funções, os compostos GUDCA e a VS que podem ser benéficos para as células da microglia hSOD1G93A com diferentes polarizações.
Descrição
Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2017
Palavras-chave
hSOD1G93A microglia activation glycoursodeoxycholic acid vinyl sulfone mIRNAs lipopolysaccharide Teses de mestrado - 2017