Indexing population size of elusive species from sign surveys: an evaluation using non-invasive genetics of Cabrera voles

Abstract

O conhecimento do tamanho e abundância de populações selvagens é fundamental para a gestão de recursos naturais. Uma das formas de estimar o tamanho de uma população é o de capturar, marcar, libertar e, mais tarde, recapturar indivíduos. Os estudos de captura-marcação-recaptura (CR) permitem ainda obter parâmetros demográficos como a taxas de sobrevivência, migração, e crescimento populacional. Mas, a obtenção de informação relativa à distribuição e tamanho das populações de espécies elusivas e/ou com problemas de conservação, é, muitas vezes, difícil recorrendo aos métodos tradicionais de armadilhagem, quer por poder haver uma resposta negativa dos animais às armadilhas, quer devido ao risco de causar danos aos animais. Para além disso, os métodos tradicionais implicam grandes quantidades de recursos materiais e humanos, sendo muito exigentes em termos de tempo, e estando maioritariamente reservados a pessoal treinado. Estas limitações muitas vezes superam os benefícios da obtenção de informação, o que constitui um desafio em estudos de ecologia e conservação. A alternativa mais comum aos métodos de captura-recaptura é o uso de métodos indiretos baseados em indícios de presença cujos resultados permitem inferir abundâncias relativas. No entanto, os índices de abundância populacional não devem ser utilizados na gestão das populações, sem uma validação prévia que avalie se as variações no índice refletem as variações de tamanho das populações. Contudo, dada a dificuldade de se conhecer o verdadeiro tamanho de uma população selvagem, a validação de índices de abundância torna-se geralmente uma tarefa difícil. Assim, uma tentativa para estimar verdadeiras abundâncias ou densidades a partir de um índice, só será suportada se houver estudos a priori onde se comparam os valores desse índice com valores de densidades reais, através de modelação estatística. Os recentes desenvolvimentos em técnicas de genética não-invasiva que permitem a captura do DNA de um individuo, em vez do individuo propriamente dito, representam uma melhoria significativa para estudos de abundância, uma vez que permitem que seja recolhida uma maior quantidade de informação. Os benefícios da CR genética incluem a diminuição do risco e perturbação para o animal, uma vez que este nunca está fisicamente preso e pode deixar várias amostras contendo material genético em múltiplas localizações durante o tempo de amostragem, baixando também o enviesamento causado pela resposta às armadilhas. A monitorização de tendências populacionais através de métodos de genética não-invasiva pode ser também uma mais valia para identificar declínios e ameaças de extinção e também para avaliar a eficácia das medidas de conservação aplicadas a uma população. O genótipo de cada indivíduo pode ser obtido de amostras não-invasivas de várias fontes. Cada genótipo específico é tratado como sendo uma “marca”, enquanto uma “recaptura” acontece de cada vez que o mesmo genótipo é encontrado em duas amostras diferentes. As fezes são o material mais utilizado em estudos de genética não-invasiva, uma vez que para a maioria das espécies, são relativamente fáceis de encontrar, e conseguem providenciar uma grande quantidade de informações relevantes (ex. perfil genético dos indivíduos, dieta, regulação hormonal, presença de DNA de parasitas, etc.). Em estudos de genética não-invasiva, é possível a utilização de diferentes marcadores para obtenção de diferentes tipos de informação. Os marcadores mitocondriais permitem a identificação da espécie enquanto que marcadores nucleares, como os microssatélites, permitem a construção do perfil genético dos indivíduos, bem como a identificação do sexo. Neste estudo utilizamos o rato de Cabrera como espécie modelo para testar a definição de índices de tamanho populacional a partir de indícios de presença, validados com estimativas obtidas a partir de amostragem genética não-invasiva. Pretendemos também perceber qual o tipo de indícios mais adequados à construção dos índices, bem como qual o esforço de amostragem mínimo necessário para a obtenção de um índice que reflita a variação no tamanho da população. O rato de Cabrera (Microtus cabrerae, Thomas 1906) é uma espécie de arvicolídeo de tamanho médio, endémico da região Iberoccitana e, atualmente, restrito à Península Ibérica, onde a sua distribuição se encontra largamente fragmentada, situação que se tem vindo a agravar nas últimas décadas. Uma vez que, para esta espécie, é difícil a obtenção de dados de abundância por armadilhagem, devido à sua resposta negativa às armadilhas, a maioria dos estudos até agora realizados têm sido baseados em regurgitações de rapinas e indícios de presença específicos, os quais são por vezes usados na construção de índices de abundância. Os indícios de presença típicos incluem túneis, fragmentos de erva cortada, e os dejetos verde escuros com 4 a 8 mm de comprimento que são frequentemente encontrados acumulados em latrinas, as quais podem ser utilizadas por um ou vários indivíduos. Estes estudos têm, até agora, permitido a obtenção de informação importante sobre abundâncias locais e dinâmicas populacionais, os quais permitiram delinear propostas de medidas de conservação a nível local e regional. O trabalho de campo foi realizado no SW de Portugal, integrando parcialmente o Parque Natural da Costa Vicentina e Sudoeste Alentejano. Foi feita uma identificação prévia dos habitats adequados à espécie, e uma procura por indícios de presença pela mesma. Em 8 dos habitats em que a presença da espécie foi confirmada, foram identificadas e contadas latrinas e recolhidas amostras de dejetos frescos usando esforço total de prospeção constante (ca. 60min/0.1ha), ao longo de quatro dias consecutivos, tendo-se recolhido um total de 601 amostras. As amostras foram extraídas e genotipadas segundo o protocolo proposto por Ferreira et al. (submetido) em condições de esterilização para minimizar os riscos de contaminação. Foram selecionadas para análise todas as amostras com pelo menos 3 dejetos, que se encontrassem a uma distância mínima de 2 metros da recolha mais próxima, totalizando 509 amostras. Estas amostras foram genotipadas para um total de 9 microssatelites, que permitem a identificação individual, e sexadas. Com os valores obtidos pelas análises de genética não-invasiva construíram-se duas curvas de rarefação, segundo os pressupostos descritos por Kohn (1999) e Eggert (2003) e com uma randomização de 100 vezes para cada habitat. Adicionalmente, como forma de verificação de concordância entre estimadores, correram-se modelos CR no Capwire (para R). Do número total de amostras recolhidas e extraídas, obtiveram-se genótipos consensuais para 129, correspondendo a um sucesso de genotipagem de cerca de 25%, semelhante ao verificado para outras espécies de pequenas dimensões ou que habitam em zonas húmidas, em que a quantidade e qualidade de DNA presente nas fezes é reduzida. As restantes amostras foram excluídas por apresentarem baixa qualidade ou estarem contaminadas. Com recurso às curvas de rarefação, foi possível obter estimativas estáveis e com valores de erro relativamente baixas. Optou-se por utilizar os resultados da curva de Eggert como referência do tamanho real das populações, uma vez que este estimador é considerado melhor que o método de Kohn quando os tamanhos populacionais são baixos, e que os modelos do Capwire só produziram resultados para 3 patches, provavelmente devido ao reduzido tamanho das populações presentes nos restantes (<7 indivíduos por patch). Das contagens de latrinas geraram-se 9 índices de tamanho populacional (PSI), contruídos segundo três esforços de amostragem distintos: 60min/0.1ha, 30min/0.1ha, 15min/0.1ha, e considerando latrinas grandes (>20 dejetos), latrinas pequenas (< 20 dejetos) e número total de latrinas. Os PSI foram correlacionados com os tamanhos populacionais de referência, através de Modelos Generalizados de Efeitos Mistos (GLMM), incluindo como fatores aleatórios o mês de amostragem e os 4 dias consecutivos de amostragem em cada habitat (pseudo-réplicas), de modo a identificar qual o PSI que melhor se correlaciona com os tamanhos populacionais de referência. Os resultados dos GLMM foram significativos apenas para o PSI que considera as contagens de latrinas pequenas com esforços de amostragem maiores, o qual se correlaciona positivamente com as estimativas de referência de tamanhos populacionais. Os resultados deste trabalho, mostraram que é possível obter um índice de tamanho populacional de forma expedita e pouco dispendiosa, com um esforço de amostragem razoável. De qualquer forma, será pertinente aumentar o número de habitats estudado de forma a validar este resultado. Com base no modelo estatisticamente suportado, a contagem de latrinas pequenas, com o esforço de amostragem maior, poderá servir para fazer inferências sobre o tamanho das populações. Como latrinas maiores possivelmente são mais usadas em épocas de acasalamento, i.e., quando indivíduos se encontram mais ativos, desaconselha-se a utilização das mesmas como índice de tamanho populacional. De ressalvar que, para além da importância de se confirmar estes resultados incluindo um maior número de habitats, estudos futuros deverão considerar a inclusão de outros indícios de presença (túneis, restos de erva cortada), assim como de esforços de amostragem maiores, de forma a quantificar mais precisamente o esforço ideal à amostragem de cada habitat. Assim, consideramos que este estudo representa o início de um caminho que poderá conduzir a novas e melhores formas de estudar as flutuações das populações do rato de Cabrera para que, no futuro, possam ser aplicados mais e melhores planos de gestão da espécie.

Understanding the factors that affect the abundance of animals in wild populations is crucial in ecological research and species conservation. However, obtaining the necessary data on elusive and endangered species is usually a challenge. Live-trapping has been used for a long time for obtaining population size estimates on several mammal species, particularly small mammals. However, live-trapping is often difficult to implement in the field and often provides insufficient data to infer population size, particularly for species that occur at low densities, or that have a negative response to trapping, or that have very extensive habitats. Recently, genetic non-invasive sampling (gNIS) has been used as an alternative to live-trapping for obtaining more data on several population parameters, including population density and abundance. By genotyping samples from wild animals without capturing or disturbing them (e.g. faeces), gNIS allows the obtainment of unique genetic fingerprint of the individuals in a population. However, when looking for an expedite and cost-effective method to sample populations, most researchers rely on population size indexes (PSI), which are usually based on counts of species presence signs, that are assumed to have a positive relation to true population size. Despite, their utility to infer population abundance, PSI’s are seldom tested against known numbers. This may result in important bias, which in turn may affect the effectiveness of conservation or management measures based solely on PSI’s index values. This study addresses the issue of obtaining expedite and cost-effective methods of surveying an elusive small mammal by generating PSI’s, and validating them against population sizes obtained via capture-recapture (CR) data from gNIS. For this, we used the Cabrera vole (Microtus cabrerae) in SW Portugal farmland as a model species. The Cabrera vole is a “Near-Threatened” Iberian endemism, restricted to relatively small habitat patches dominated by wet herbaceous vegetation. These habitats have decreased dramatically during the past, mainly due to agricultural intensification. Between November-16 and March-17, we selected 8 occupied habitat patches, and in each one we searched and counted vole latrines, and collected fresh faeces samples for genotyping, based on 9 microsatellite loci and 1 mitochondrial loci. From the vole latrine counts we generated 9 PSI indexes based on varying sampling efforts and type presence sign considered. We then used GLMM to assess the relationship between each of the 9 PSI’s and the estimates of population size, obtained from Eggert’s rarefaction curve applied to the gNIS data. Results indicated that, despite the relatively low genotyping success (ca. 25%), population size estimates based on gNIS were robust, and correlated significantly with the PSI based on counts of small latrines (<20 faeces) under higher sampling efforts (≥60 min/0.1ha). Our study suggests that it is possible to use PSIs for monitoring Cabrera vole’s populations, which may thus provide an opportunity for monitoring the species over large spatial and temporal scales.