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Publicação
Easy embryonicStem cell: a new tool to manipulate gene expression in embryoid bodies
| Nome: | Descrição: | Tamanho: | Formato: | |
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Orientador(es)
Resumo(s)
O sistema vascular permite a distribuição adequada de sangue e consequente fornecimento de oxigénio e nutrientes a todos os tecidos em vários organismos multicelulares. O sistema vascular é essencial para o desenvolvimento embrionário, o crescimento de tecidos e o processo de cicatrização. De especial interesse, muitas doenças que afectam o ser-humano, como por exemplo retinopatia diabética, isquemia, acidente vascular cerebral e crescimento de tumores sólidos, surgem devido a má formação e disfunção dos vasos sanguíneos. A formação de uma rede vascular funcional requer a extensão dos vasos sanguíneos pré-existentes pelo processo de angiogénese de forma a alcançar os tecidos não vascularizados e, em simultâneo, a remodelação do plexo vascular primitivo amorfo criado por angiogénese numa rede hierarquizada de artérias, veias e capilares. Estes dois processos são fortemente regulados pela comunicação molecular entre as células dos tecidos e as células endoteliais (as células que revestem os vasos sanguíneos). De especial relevância, começa agora a ser evidente que as células endoteliais necessitam de coordenar os seus comportamentos individuais para permitir a organização de uma rede vascular de forma coerente e funcional. É, por isso, importante compreender os mecanismos moleculares de regulação do comportamento coordenando das células endoteliais durante as diferentes fases do processo de formação dos vasos sanguíneos, sendo que isso irá certamente criar novas possibilidades de tratamento médico de várias doenças vasculares e melhorar o impacto das terapias existentes na saúde humana. Nos últimos anos temos assistido a um aumento significante tanto no desenvolvimento como no uso de tecnologias transgénicas, usadas em estudos que visam a nossa compreensão dos mecanismos biológicos, mas que têm também facilitado o desenvolvimento de uma vasta panóplia de modelos de doenças que têm grande impacto na abordagem das patologias humanas. As células estaminais embrionárias derivam de células totipotentes embrionárias e, como tal, servem como fonte putativa de vários tipos de células diferenciadas, dando origem a todos os tipos celulares do organismo. Existem duas características que distinguem as células estaminais embrionárias das restantes: a sua pluripotência e a sua capacidade de auto-renovação sob determinadas condições e, como tal, quando geneticamente modificadas in vitro, podem ser utilizadas no estudo de vários mecanismos biológicos em diferentes ensaios. Particularmente, as células estaminais embrionárias podem ser utilizadas em ensaios sobre angiogénese a partir da criação de corpos embrióides, que resultam da agregação in vitro destas células e que permitem testar o potencial das mesmas. A principal vantagem deste sistema, neste contexto, é poder ser manipulado a partir da utilização de células estaminais embrionárias distintas com diferentes modificações ou origem genética, criando quimeras que permitem a visualização da dinâmica das células endoteliais e o estudo da eficiência das diferentes fases do processo de formação dos vasos sanguíneos durante a angiogénese. As tecnologias correntemente desenvolvidas para inserir um gene numa célula viva estão limitadas pela natureza aleatória desta inserção no genoma da mesma. O novo gene, ao ser posicionado arbitrariamente, pode inactivar ou perturbar o funcionamento de genes endógenos, causando efeitos indesejados na célula. Adicionalmente, estas tecnologias não permitem a reprodutibilidade do processo uma vez que não há garantia de que a nova sequência seja inserida na mesma posição do genoma em duas células diferentes. Este problema pode ser contornado utilizando tecnologias que permitem recombinação homóloga, na inserção de transgenes em locais específicos ou em modificações in situ de genes existentes, mas que são muito morosas pela necessidade de alcançar e seleccionar os clones positivos. De forma ultrapassar as dificuldades supramencionadas, pretendemos aumentar a eficiência e velocidade do processo de inserção de genes em células a partir do desenvolvimento de um método de fácil utilização para a manipulação de células estaminais embrionárias para o estudo em corpos embrióides. Para tal, pretendemos recorrer à actividade de um tipo de enzimas específico que reconhece curtas sequências de ADN que medeia a recombinação entre estes elementos, resultando em excisão, integração, inversão e substituição dos fragmentos de ADN, as chamadas site-specific recombinases (de sequência específica). Dentro desta família de enzimas, existe uma, a integrase PhiC31, que por recombinação homóloga e através de locais específicos de fixação, consegue integrar um fragmento de ADN de qualquer dimensão, de forma específica e irreversível. Com base neste mecanismo, desenvolvemos dois vectores, cada um deles com os locais de fixação específicos, sendo que um deles possui o genoma alvo e o segundo, o gene que pretendemos introduzir na célula. Através da expressão endógena de integrase PhiC31, a sequência de interesse será introduzida no genoma da célula de forma específica e eficiente, prevenindo a disrupção de genes endógenos e oferecendo perfeita reprodutibilidade. A principal vantagem desta ferramenta para o nosso laboratório prende-se com o facto de facilitar a manipulação de células estaminais embrionárias, que permitem a criação de corpos embrióides quiméricos para a visualização da dinâmica das células endoteliais e a eficiência de migração durante o processo angiogénico. Até ao momento a nossa estratégia revelou ser promissora, tendo a expressão de integrase PhiC31 sido bem-sucedida em células cancerígenas em cultura mas, faltando ainda concluir a validação do vector de expressão, que revelou deformidades. A próxima fase será extrapolar a técnica para células estaminais embrionárias para que seja aprovada e posteriormente aplicada a diferentes ensaios em outras áreas da biologia.
The established transgenesis methods used in embryonic stem cells allow efficient genomic integration of transgenes. However, the integration of multiple copies or transgenes at random genomic locations complicates comparative transgene analysis and makes long-term transgene stability unpredictable with variable expression. Targeted, site-directed transgene integration into pre-determined genomic loci can circumvent these issues, enabling direct comparison of different transgenes, thereby improving time and cost efficiency. The PhiC31 integrase catalyzes the unidirectional recombination reaction between heterotypic attP and attB sites and is an efficient platform for site-directed transgenesis. Here, we implemented an efficient PhiC31-based site-specific transgenesis system for embryonic stem cells to be used in embryoid bodies’ studies. It allows the recombination of attB-containing transgene vectors into single genomic attP landing sites being this enzyme endogenously expressed by the cell, avoiding PhiC31 integrase encoding mRNA injection. Our strategy revealed a great potential as, cancer cells in culture were able to express PhiC31 integrase but, the validation of the expression vector is still ongoing due to deformities in the plasmid. The next step will be validating the technique in embryonic stem cells. The major advantage of this system for our laboratory is that it can easily be manipulated by using different transgenic embryonic stem cells, creating chimeras to visualize the dynamics of endothelial cells and study the efficiency of sprouting and migration during angiogenesis. This tool can also be applied to many other assays in transversal fields of biology. We hope that our results help researchers to optimize genome editing in their specific systems.
The established transgenesis methods used in embryonic stem cells allow efficient genomic integration of transgenes. However, the integration of multiple copies or transgenes at random genomic locations complicates comparative transgene analysis and makes long-term transgene stability unpredictable with variable expression. Targeted, site-directed transgene integration into pre-determined genomic loci can circumvent these issues, enabling direct comparison of different transgenes, thereby improving time and cost efficiency. The PhiC31 integrase catalyzes the unidirectional recombination reaction between heterotypic attP and attB sites and is an efficient platform for site-directed transgenesis. Here, we implemented an efficient PhiC31-based site-specific transgenesis system for embryonic stem cells to be used in embryoid bodies’ studies. It allows the recombination of attB-containing transgene vectors into single genomic attP landing sites being this enzyme endogenously expressed by the cell, avoiding PhiC31 integrase encoding mRNA injection. Our strategy revealed a great potential as, cancer cells in culture were able to express PhiC31 integrase but, the validation of the expression vector is still ongoing due to deformities in the plasmid. The next step will be validating the technique in embryonic stem cells. The major advantage of this system for our laboratory is that it can easily be manipulated by using different transgenic embryonic stem cells, creating chimeras to visualize the dynamics of endothelial cells and study the efficiency of sprouting and migration during angiogenesis. This tool can also be applied to many other assays in transversal fields of biology. We hope that our results help researchers to optimize genome editing in their specific systems.
Descrição
Tese de mestrado integrado, Engenharia Biomédica e Biofísica (Engenharia Clínica e Instrumentação Médica)Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2016
Palavras-chave
Vasos sanguíneos Rede vascular Angiogénese Células endoteliais Células estaminais embrionárias Corpos embrióides Integrase PhiC31 Teses de mestrado - 2016