Polyfunctionalized carbohydrate-derived scaffolds for the production of libraries of bioactive compounds

Abstract

Inspired by the role of carbohydrates as natural scaffolds, we exploited the sugar skeleton to generate new libraries of polyfunctionalized compounds as GABAA receptor ligands. Hybrids of benzodiazepines, γ-butyrolactone and -lactam derivatives, and a GABA analogue were developed. The incorporated sugar moiety offered the possibility of diverse and controlled functionalization, modulating physicochemical and structural properties, namely solubility and rigidity, and consequently biological activity of the synthesized scaffolds. 1,4-Benzodiazepine-2,5-dione scaffolds (i and iv) derived from spiro bicyclic D- or Lproline analogues (ii and v), containing a D- or a L-fructose moiety were synthesized in the present work. The D-proline analogue ii was prepared in a sixteen-step synthesis in 24% overall yield, adopting a methodology which used D-fructose as starting material and 3-C-(3,4,6-tri-O-benzyl-α-D-fructofuranos-2-yl)propene iii as key intermediate. Instead, the L-fructose moiety, required for the preparation of the corresponding L-proline analogue v, was obtained using a new synthetic pathway. The key intermediate of this synthesis, the 3-C-(3,4,6-tri-O-benzyl-α-L-fructofuranos-2- yl)propene vi, was effectively obtained from L-arabinose through a seven steps pathway in 13.5% overall yield. This starting material embodies the furanose ring with the appropriate configuration. Hence, a one carbon chain elongation at the anomeric position lead to the desired L-fructose derivative, compound vi. For that purpose, oxidation to arabinonolactone, formyl group introduction via a dithiated intermediate and reduction to the primary alcohol were performed. The subsequent eleven-step synthesis afforded the new spiro bicyclic L-proline analogue v in 24% overall yield. In addition, a procedure previously reported for L-fructose synthesis was also used to obtain 3-C-(3,4,6-tri-O-benzyl-α-L-fructofuranos-2-yl)propene vi. Starting from L-sorbose, diisopropylidene protection, mesylation, selective deprotection, oxirane formation and opening led to inversion of configuration at C-3 and C-4 affording the stereochemistry of L-fructose. The key intermediate vi was obtained by this eight-step synthesis with a 8.5% overall yield. Molecular modelling calculations, NMR studies at variable temperature (dynamic NMR–DNMR) and preliminary biological studies were also performed on these compound libraries of enantiomeric fructose–proline–benzodiazepine derivatives (i and iv). The proline moiety linked to the fructose derivative through a spiro junction and consequent fusion of this bicyclic structure to the benzodiazepine ring promoted high conformational rigidity to the hybrid scaffold. Therefore, the conformational equilibrium normally occurring with (P) and (M) benzodiazepine conformers was not observed. The benzodiazepine derivatives synthesized adopted a rigid conformation in which the C-11a substituent was always pseudo-equatorial. The diverse and controlled functionalization of these molecules (i and iv) was achieved using different isatoic anhydride types which are commercially available. Coupling of D- or L-proline analogues, ii and v, respectively, with the suitably functionalized isatoic anhydride, afforded the desired sugar-based pyrrolobenzodiazepine library (i and iv). These compounds weres functionalized not only with electronegative substituents, such as –Cl, –Br and –NO2, but also with –NH2 at position seven, while at position ten the presence of –CH3 is expected to give a more appropriate binding affinity, as suggested by reported QSAR studies. The ability of these compounds to displace the [3H]flunitrazepam from the GABAA receptor was measured with a competition binding assay using rat cortical membrane. It was observed that substitution on both positions are crucial for binding affinities, being particularly effective –NO2 and –NH2 groups. The free –OH or –CH2Ph groups on the sugar offered the possibility to balance hydrophilic/lipophilic for tuning the pharmacokinetic properties and the binding affinities of the potential drug. As expected, water soluble sugar-based pyrrolobenzodiazepine derivatives, i.e. with –OH groups, presented highest binding affinities. The effect of conformational changes in the 1,4-benzodiazepine-2,5-dione ring and of different substituents allowed an evaluation of binding affinities at the benzodiazepine site on the GABAA receptor. Additionally, was developed the synthesis of β-disubstituted D-fructose-based γ-butyrolactone vii and γ-butyrolactam analogues viii, and that of a lipophilic D-fructose-based GABA analogue ix, where the pharmacophore is engineered into the carbohydrate scaffold through a spiro junction. The ability to bind GABAA receptor, using a radioligand binding technique, was evaluated for all these compounds. GABA lactones vii were synthesized via the key intermediate 3-C-(3,4,6-tri-O-benzyl-α-Dfructofuranos- 2-yl)propene iii, while γ-butyrolactams viii and GABA analogue ix took advantage of the allyl group and an amino functionality replacing the hydroxyl group in iii. The fructose moiety acted as versatile scaffold, rich in stereochemistry and with a relatively rigid skeleton. Thus, additional hydroxyl derivatization was used to increase lipophilicity, as well as to modulate the activity of pharmacophores or the receptor specificity, since benzyl groups could facilitate blood-brain barrier (BBB) crossing, which is one of the main issues to be addressed for central nervous system (CNS) directed drugs.

Os hidratos de carbono constituem uma família única de compostos polifuncionais com primordial importância em química e biologia. Funcionalidade, quiralidade e diversidade estrutural são algumas das suas características mais relevantes. Neste contexto, dirigimos esta investigação para a síntese de novas estruturas que possuem unidades monossacarídicas com rigidez estrutural e ainda uma complexidade e diversidade tais que permitiram a construção de novas bibliotecas de compostos bioactivos. Inspirados pela proeminente utilidade dos hidratos de carbono como scaffolds em química medicinal, foram sintetizadas duas bibliotecas de potenciais ligandos do receptor GABAA, geradas a partir da D-fructose e de um derivado da L-fructose. A primeira biblioteca de compostos inclui várias estruturas análogas às benzodiazepinas e a segunda contém γ-butirolactonas, γ-butirolactamas e um análogo do ácido gama-aminobutírico (GABA). Todos estes compostos foram submetidos a ensaios biológicos, nomeadamente utilizando a técnica que investiga a competição entre o composto e o radioligando correspondente relativamente à afinidade para a ligação ao receptor no seu local específico. O GABA é um neurotransmissor inibidor do sistema nervoso central. Os seus efeitos resultam principalmente da sua ligação ao receptor GABAA, que constitui uma estrutura macromolecular em volta de um canal iónico permeável ao cloreto. A fixação do GABA ao receptor GABAA causa um aumento da condutância da membrana celular ao cloreto, que habitualmente existe em maior concentração no exterior do que no interior da célula. O movimento de aniões para dentro da célula aumenta a diferença de potencial entre a face externa e a interna da membrana celular e reduz a excitabilidade neuronal. O GABA funciona como uma molécula reguladora de efeitos tais como ansiedade, depressão, insónias, convulsões, tensão ou relaxamento muscular, actividade epiléptica, memória, euforia e disforia. O receptor GABAA tem locais específicos de ligação para distintas moléculas que influenciam a actividade do GABA, tais como benzodiazepinas, barbitúricos, etanol, esteróides, etc. As benzodiazepinas são um grupo de fármacos ansiolíticos utilizados no tratamento sintomático da ansiedade, insónia, depressão e distúrbios mentais em geral. Estas moléculas ligam-se a um local próprio, denominado receptor das benzodiazepinas, e aumentam a afinidade do GABA para o receptor GABAA. Os barbitúricos, por exemplo, fixam-se também ao receptor GABAA e provocam uma abertura prolongada do canal do cloreto. Diferem das benzodiazepinas porque a abertura do canal não exige a presença de GABA, ao contrário das benzodiazepinas que se limitam a potenciar o efeito do GABA endógeno. Além disso a abertura é mais prolongada, enquanto que as benzodiazepinas aumentam a frequência das aberturas sem prolongarem a duração de cada uma delas. no presente trabalho é apresentada a síntese de uma biblioteca de enantiómeros análogos das benzodiazepinas, i e iv, desenvolvidos a partir da D-frutose e de um derivado da L-frutose, respectivamente. A estratégia adoptada centrou-se na síntese de um novo análogo da D- e da L-prolina, ii e v, respectivamente, com uma estrutura bicíclica espiro que contém a unidade sacarídica. A junção espiro reduziu significativamente a flexibilidade molecular, induzindo restrições conformacionais ao anel da prolina e consequentemente a toda a estrutura da molécula final (comprovado por NMR a temperaturas variáveis e estudos de modelação molecular). A escolha do monossacárido frutose resultou do facto deste açúcar oferecer potencialidades interessantes devido à presença de grupos hidroximetilo (em C-1 e C- 6) e devido à reactividade única do seu carbono anomérico. A síntese de derivados protegidos da frutose baseia-se na ramificação no carbono C-2 (iii e vi) e posterior reacção de ciclização entre uma função amina e um grupo alilo ligado à posição anomérica dando origem ao anel de pirrolidina seguidamente transformado no aminoácido ii e v. O plano de síntese para o análogo da D-proline ii, envolveu a metilação da posição anomérica e benzilação das restantes posições utilizando a metodologia clássica (NaH, BnBr, DMF). Seguidamente foi introduzido um grupo alilo na posição anomérica através da formação de uma ligação C-C com aliltrimetilsilano mediada por um ácido de Lewis. A reacção dá-se geralmente por intermédio de um ião oxocarbénio cíclico, o qual sofre um ataque nucleófilo estereoquimicamente controlado, conduzindo a uma elevada estereoselectividade tanto em anéis de piranose como em anéis de furanose. Consequentemente, o tratamento de 1,3,4,6-tetra-O-benzilfrutofuranósido de metilo com aliltrimetilsilano na presença de eterato de trifluoreto de boro originou 3-C-(1,3,4,6-tetra-O-benzilfrutofuranos-2-il)propeno. A relação espacial entre a ligação dupla e o oxigénio do grupo benziloxi do carbono C-1 favorece a ocorrência da ciclização 5-exo por tratamento com iodo, desprotegendo selectivamente o grupo hidroxilo primário de C-1. A introdução da amina foi realizada através da oxidação a aldeído do álcool primário, formação de oxima e redução com hidreto de alumínio e lítio. Uma segunda iodociclização, desta vez envolvendo a função amina, protegida com um grupo carbamato, e o grupo alilo, conduziu à formação do anel pirrolidina. Tratamento com hidróxido de sódio permitiu, através da formação de uma oxazolidinona intermediária, obter o composto que possui a função álcool primário e a estereoquímica desejada. A sua oxidação conduziu à síntese do aminoácido prolina. O plano de síntese do análogo da L-proline v envolveu a preparação de um derivado da L-frutose, uma vez que este açúcar não natural é comercializado a um preço bastante elevado. Foram desenvolvidas duas metodologias para a formação do intermediáriochave, o composto 3-C-(3,4,6-tetra-O-benzil-α-L-frutofuranos-2-il)propeno, uma das quais se baseou num procedimento descrito em literatura para a síntese da L-frutose, o qual usa a L-sorbose como composto de partida. Esta estratégia baseia-se na inversão da configuração das posições três e quatro para obter assim o intermediáriochave com a configuração do açúcar desejada. A estratégia alternativa desenvolvida partiu da L-arabinose, a qual possui a estereoquímica pretendida, resultou no alongamento da cadeia carbonada em C-1. Esta síntese é mais directa e permite obter a molécula-alvo com um rendimento ligeiramente superior (13,5% rendimento total) do que a utilizada inicialmente (8,5% rendimento total). O uso do aminoácido prolina na produção de pirrolobenzodiazepinas foi estabelecido como sendo um dos processos sintéticos mais eficazes e rentáveis, através do uso de anidrido isatóico em DMF e refluxo. O reagente anidrido isatóico pode ser diversamente substituído permitindo a obtenção de uma variada biblioteca de compostos, nomeadamente benzodiazepinas substituídas na posição sete com halogéneos (Br e Cl), grupos amina ou nitroílo e metiladas em N (posição dez). O nosso contributo singular na estrutura das benzodiazepinas consistiu na incorporação de um açúcar de modo a funcionalizar os grupos hidroxilo e modular as propriedades físico-químicas e estruturais, nomeadamente a solubilidade e a rigidez, e consequentemente a actividade biológica do potencial fármaco. A síntese destas estruturas rígidas teve como objectivo, não só permitir o estudo da relação estrutura-actividade, mas também uma análise acurada da especificidade conformacional do local de ligação no receptor das benzodiazepinas. Conforme descrito na literatura, o anel diazepina das benzodiazepinas tem um equilíbrio conformacional entre os confórmeros (M) e (P) e a ligação das mesmas ao receptor é dependente da conformação adoptada por estas. Embora existam estudos prévios que demonstraram que o receptor é favorável à conformação (M), a investigação desenvolvida no âmbito desta tese, utilizando enantiómeros conformacionalmente rígidos no anel diazepam, permitiu concluir que ambas as conformações apresentam actividades biológicas semelhantes para estes compostos. As actividades biológicas determinadas demonstraram que a contribuição mais significativa para a ligação específica ao receptor provém dos substituintes no anel do benzeno, nomeadamente os grupos amina e nitroílo (posição sete), bem como a N-metilação. Os grupos hidroxilo do açúcar também contribuíram para um aumento da actividade biológica. Paralelamente a estes análogos das benzodiazepinas, desenvolvemos uma segunda biblioteca de compostos, igualmente potenciais ligandos do receptor GABAA. Foram sintetizadas γ-butirolactonas e γ-butirolactamas β-disubstituídas, vii e viii, respectivamente, e um derivado do GABA ix. Estas estruturas bicíclicas possuem uma junção espiro com um derivado da D-frutose. Os resultados de estudos farmacológicos, envolvendo radioligandos através de ensaios de competição entre o composto e o muscimol marcado, indicaram que as lactamas são os compostos com maior actividade biológica, seguidas das lactonas. O açúcar mostrou ser uma estrutura esteroquimicamente não impeditiva para a ligação ao receptor e até mesmo os compostos benzilados tiveram actividades biológicas interessantes, o que reforça a importância de estruturas lipofílicas para atravessar a barreira hemato-encefálica (BHE). Em resumo podemos assumir que o trabalho desenvolvido conduziu ao desenvolvimento de novas estruturas glucídicas para a produção de novas bibliotecas de compostos com interesse farmacológico, que são excelentes candidatos para investigações de estrutura-actividade no receptor GABAA.