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Establishing 3D models to dissect the role of basement membrane-cell communication in cancer
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Orientador(es)
Resumo(s)
O cancro tem vindo a tornar-se um dos maiores desafios sociais, económicos e de saúde pública no
século XXI. Esta patologia é já a segunda causa de morte prematura causada por doenças nãotransmissíveis em vários países e prevê-se que esta situação se venha a agravar. Um dos tipos de cancro
que mais rapidamente tem aumentado é o melanoma, um cancro da pele, que em 2022 foi o 17º cancro
mais diagnosticado a nível global. Esta doença advém de alterações genéticas e epigenéticas em
melanócitos, células encontradas em vários tecidos onde desempenham diversas funções. Na camada
basal da epiderme a principal função destes melanócitos é a produção de melanina, pigmento que
absorve e dispersa radiação ultravioleta, danificadora do DNA, o que é extremamente importante na
pele, cujas células são regularmente expostas a esta radiação.
As alterações que levam à transformação de melanócitos em melanoma são resultado de vários
fatores extrínsecos e intrínsecos. Assim o melanoma é, como todos os cancros, uma doença complexa e
multifatorial, que pode ser caracterizada por uma série de caracteres denominados cancer hallmarks.
Estes definem as características biológicas fundamentais adquiridas durante a progressão tumoral que
caracterizam o aparecimento do cancro. Exemplos incluem proliferação contínua, resistência à apoptose,
imortalidade replicativa, angiogénese e ativação de invasão e metástase.
A matriz extracelular (ECM) é uma rede acelular complexa composta por várias moléculas. As mais
abundantes são colagénios, elastina, glicoproteínas (como fibronectina e lamininas) e proteoglicanos.
Tradicionalmente a ECM era vista como uma simples estrutura de suporte, mas hoje sabe-se que as suas
funções são muito mais complexas. Para além do suporte mecânico a ECM é também responsável por
regular processos fundamentais para a manutenção da homeostase de células e tecidos, incluindo
proliferação, diferenciação e migração celular. Dado este papel fundamental não é surpreendente que
alterações na estrutura e composição da ECM tenham uma grande importância na modulação dos acima
mencionados cancer hallmarks. Por exemplo, sabe-se que deposição excessiva de certos componentes
da matriz, comum em vários tipos de cancro, leva ao aumento da sua rigidez, que por sua vez promove
aumento da proliferação celular, resistência à apoptose e angiogénese. Por outro lado, uma remodelação
excessiva da ECM pode levar ao enfraquecimento da membrana basal e assim facilitar a invasão de
tecidos. Outras alterações da matriz podem ainda facilitar a tumorigénese através do aumento da
instabilidade genómica, como certas mutações em colagénios.
Tendo em conta a função crítica da ECM na progressão tumoral torna-se prioritário estudar a forma
como alterações nesta estrutura afetam esta progressão para aprofundar o conhecimento desta doença.
Para tal modelos in vitro são fundamentais. Este tipo de modelo biológico tem sido usado em
investigação há décadas, tendo sido usados para compreender um grande número de processos e
mecanismos biológicos, tanto em homeostase como em doença. Culturas de células em monocamada
bidimensionais (2D) são um dos modelos mais usados, devido à sua simplicidade, consistência e
conveniência. Várias descobertas relativas aos cancer hallmarks foram feitas nestes modelos e têm sido
regularmente usados no processo de teste de novas drogas e agentes quimioterapêuticos. Não obstante
o seu uso extensivo, existem vários aspetos em que estes modelos 2D não representam fielmente a
condição in vivo. É frequente células cultivadas em monocamada terem funções biológicas alteradas,
com propriedades como proliferação, apoptose, metabolismo e regulação transcricional de algum modo
diferentes em relação ao que é observado in vivo. Devido a estas diferenças os resultados obtidos com
estes modelos podem ter um poder preditivo pobre. Culturas 2D são especialmente ineficientes no que
se refere a simular a ECM, uma vez que o seu modo de crescimento limita as interações célula-célula e
previne o estabelecimento de uma ECM. Deste modo modelos 2D não são apropriados para o estudo de
questões que envolvam a ECM. Para tal modelos tridimensionais (3D) apresentam-se como uma melhor
alternativa. Este tipo de modelo permite o crescimento de células num ambiente 3D e, consequentemente, o estabelecimento de mais e mais complexas interações célula-célula e célula-matriz.
Um tipo de modelo 3D comumente usado são esferoides. Estes consistem em agregados de células
flutuantes, que se sabe produzirem a sua própria ECM. Além disso, por serem 3D, existe o
estabelecimento de um gradiente de nutrientes, pH e oxigénio do exterior para o interior do esferoide, o
que é especialmente apropriado para o mimetismo de tumores sólidos. Estes modelos são relativamente
baratos e fáceis de usar e por isso têm sido usados para explorar diversos aspetos relacionados com o
cancro, como por exemplo invasão e resposta a tratamentos. Dito isto torna-se claro que para explorar o
papel da ECM na progressão tumoral o uso de modelos 3D, como esferoides, será uma escolha vantajosa.
Neste sentido o objetivo principal deste projeto foi o estabelecimento de esferoides com células de
melanoma para investigar o papel da ECM e suas alterações, especificamente em LAMA2, que codifica
para a cadeia α2 das lamininas. Para tal foram inicialmente testados dois métodos de geração de
esferoides, usando células A375 (uma linha celular de melanoma humano) wild-type (WT): hanging
drops, em que a formação de esferoides é promovida pela gravidade, e agarose-coated wells, em que
poços de uma placa de 96-poços são cobertos em agarose que impede a aderência de células ao fundo e
por isso promove a formação de esferoides. Foi possível gerar esferoides através de ambos os métodos,
no entanto os esferoides gerados por hanging drops aparentaram ser menos coesos e mais frágeis. Esse
facto, adicionado à necessidade de maior manipulação, levou a que o método agarose-coated wells fosse
escolhido para gerar esferoides em experiências subsequentes. Após determinar o melhor método para
a sua obtenção, esferoides gerados usando células A375 WT e LAMA2 knockout (KO) foram
caracterizados em termos de crescimento, proliferação e morte celular. Não foram observadas diferenças
significativas em qualquer um destes parâmetros entre linhas celulares. Tanto o crescimento como a
proliferação se mantiveram constantes durante o período experimental e a morte celular observada foi
notavelmente baixa, não ultrapassando os 2% em qualquer uma das linhas. Estes esferoides foram ainda
usados para analisar o impacto da ausência de LAMA2 noutras proteínas da ECM e na comunicação
célula-ECM. Através de imunofluorescência foi determinado que esferoides LAMA2-KO apresentam
menos laminina-α2 que esferoides WT, como esperado, e que os níveis de fibronectina parecem seguir
o mesmo padrão. Não foram observadas diferenças nos níveis de pan-lamininas, o que poderá indicar a
existência de um sistema compensatório. Em relação à comunicação célula-ECM foi utilizado Western
Blot para quantificar a ativação de STAT3, proteína responsável pela transdução de sinais extracelulares
e cujo gene codificante é um conhecido oncogene. Não foram observadas diferenças na ativação de
STAT3 entre esferoides WT ou LAMA2-KO. A técnica de PCR quantitativo (qPCR) foi também usada
para determinar os níveis de expressão de dois genes de interesse (GOI) identificados na plataforma
cBioPortal como estando alterados em amostras de melanoma com alterações em LAMA2: MXRA5 e
MAPK6. Não foram encontradas diferenças significativas na expressão destes genes entre esferoides de
diferentes linhas celulares, apesar de MXRA5 ter tido uma ligeira tendência para uma maior expressão
em esferoides LAMA2-KO.
Para além do objetivo principal este projeto teve ainda como objetivo secundário estabelecer uma
linha celular A375 de sobre-expressão de LAMA2 (OE). Para o fazer foi escolhido o sistema CRISPR
activation (CRISPRa), que permite a sobre-expressão de um gene guiando um ativador transcricional
(neste caso VP64) até à zona do promotor desse gene, usando RNAs guia (gRNAs) e uma CAS9
endonuclease morta (dCAS9). gRNAs para a zona promotora do gene LAMA2 foram definidos
utilizando vários programas públicos e os plasmídeos usados para a originar a linha foram gerados pela
inserção desses gRNAs num lentiSAM v2 backbone, através de clonagem molecular. Após confirmar a
inserção correta destes gRNAs células A375 foram transfetadas e selcionadas. Para além das linhas
LAMA2-OE foi também gerada uma linha scramble, que serviu de controlo. Os níveis de expressão de
LAMA2 foram verificados através de qPCR e pelo menos uma das linhas geradas teve expressão
significativamente maior que a linha WT. Por fim estas novas linhas celulares foram também utilizadas para gerar esferoides. Estes foram
caracterizados em termos de crescimento e morte celular. Não foram observadas diferenças
significativas em termos de crescimento ou morte celular, que tal como anteriormente não excedeu os
2%. A expressão de MXRA5 e MAPK6 foi também avaliada, não tendo sido observadas diferenças
significativas. Ainda assim a expressão de MXRA5 aparentou ter uma ligeira tendência para aumentar
nos esferoides LAMA2-OE. Em conjunto com a tendência anterior é possível que exista uma relação
entre os níveis de MXRA5 e LAMA2, sendo necessárias mais experiências para descortinar se tal relação
de facto existe.
No geral este projeto foi bem-sucedido no estabelecimento de um modelo 3D para investigar o papel
da ECM, e em particular LAMA2, na progressão tumoral. A geração de uma linha de sobre-expressão
de LAMA2 representa também um passo importante para a investigação futura do papel deste gene em
melanoma e potencialmente noutros cancros e doenças. Apesar de não necessariamente significativos,
os resultados preliminares obtidos, em conjunto com estas importantes ferramentas, abrem o caminho a
trabalhos futuros.
Like all cancers, melanoma is a multifactorial disease characterised by several cancer hallmarks. Previously thought to be a support structure, the extracellular matrix (ECM) is now known to govern many of the processes related to these hallmarks, such as cell proliferation, apoptosis and invasion. Therefore, understanding the role of this structure in tumour progression is paramount to deepening our knowledge of this disease. In vitro models are a fundamental part of this research; however, classical two-dimensional monolayer cell cultures are known to not accurately represent the ECM. Threedimensional (3D) models are better at this, since they allow the formation of the complex cell-cell and cell-matrix interactions that are vital to evaluate the impact of the ECM. This project aimed to establish spheroids, a type of 3D model, to study the effect of ECM mutations in tumour progression, focusing on the effects of LAMA2 abnormalities, a key ECM component. In this project we showed that the A375 human melanoma cell line was able to form spheroids, and this characteristic was not altered in the context of LAMA2 knockout (KO) or LAMA2 overexpression (OE). These spheroids were characterized in terms of cell proliferation, cell death, growth and the expression of some genes of interest (GOIs). Results indicated that most cells in each spheroid were viable during the time of the analysis, suggesting the feasibility of the models used. No differences were found in proliferation, cell death, growth or the expression of the analysed genes due to LAMA2 absence or overexpression. ECM and ECM related components were also analysed. Fibronectin levels appeared to be correlated with laminin-α2 presence, since less laminin-α2 led to a decrease in fibronectin. Overall, this project lays the foundation for the use of spheroid models to the study the role of the ECM and LAMA2 in tumour progression.
Like all cancers, melanoma is a multifactorial disease characterised by several cancer hallmarks. Previously thought to be a support structure, the extracellular matrix (ECM) is now known to govern many of the processes related to these hallmarks, such as cell proliferation, apoptosis and invasion. Therefore, understanding the role of this structure in tumour progression is paramount to deepening our knowledge of this disease. In vitro models are a fundamental part of this research; however, classical two-dimensional monolayer cell cultures are known to not accurately represent the ECM. Threedimensional (3D) models are better at this, since they allow the formation of the complex cell-cell and cell-matrix interactions that are vital to evaluate the impact of the ECM. This project aimed to establish spheroids, a type of 3D model, to study the effect of ECM mutations in tumour progression, focusing on the effects of LAMA2 abnormalities, a key ECM component. In this project we showed that the A375 human melanoma cell line was able to form spheroids, and this characteristic was not altered in the context of LAMA2 knockout (KO) or LAMA2 overexpression (OE). These spheroids were characterized in terms of cell proliferation, cell death, growth and the expression of some genes of interest (GOIs). Results indicated that most cells in each spheroid were viable during the time of the analysis, suggesting the feasibility of the models used. No differences were found in proliferation, cell death, growth or the expression of the analysed genes due to LAMA2 absence or overexpression. ECM and ECM related components were also analysed. Fibronectin levels appeared to be correlated with laminin-α2 presence, since less laminin-α2 led to a decrease in fibronectin. Overall, this project lays the foundation for the use of spheroid models to the study the role of the ECM and LAMA2 in tumour progression.
Descrição
Tese de Mestrado, Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências
Palavras-chave
Melanoma Esferoides LAMA2 Sobre-expressão Matriz Extracelular Teses de mestrado - 2024