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Abstract(s)
Os epitélios pseudoestratificados são tecidos constituídos por uma única camada de células cujo
comprimento ou forma varia. Estes tecidos atuam como precursores de diversos órgãos em
invertebrados e vertebrados. Uma característica que lhes é transversal é o facto de as divisões celulares
ocorrerem na parte apical do tecido.
Nestes epitélios, os núcleos ocupam diversas posições ao longo da célula, daí a aparência
estratificada que lhes dá nome. Isto acontece porque os movimentos nucleares estão associados ao ciclo
celular: durante as fases G1 e S o núcleo apresenta movimentos estocásticos, já na fase G2, o núcleo
migra de forma rápida e direta para a parte apical da célula. Esta migração é crucial uma vez que, quando
a divisão nuclear ocorre numa posição subapical, a integridade do tecido fica comprometida.
Tipicamente, os epitélios pseudoestratificados são tecidos altamente proliferativos. Como tal,
o número de células e núcleos aumenta muito rapidamente ao longo do desenvolvimento. O consequente
aumento de núcleos por unidade de área, diminui progressivamente o espaço disponível, obrigando a
que a migração nuclear ocorra em espaços cada vez mais apertados.
Os elementos citoplasmáticos que garantem a translocação do núcleo para parte apical da célula
têm sido amplamente estudados. Na retina, por exemplo, o movimento é dependente de actomiosina.
Não é claro, no entanto se outros fatores, tais como as propriedades intrínsecas do núcleo contribuem
para o seu movimento. A maior parte dos estudos sobre a migração nuclear através de espaços apertados,
foi realizada in vitro, recorrendo ensaios de migração celular por microcanais artificiais ou
microaspiração. Averiguou-se que um dos fatores que garante uma migração eficiente é capacidade de
os núcleos se adaptarem à constrição imposta. Nestes estudos, as propriedades materiais do núcleo, em
particular a sua capacidade de deformar foram associadas à eficiência da sua migração.
Uma forma de estudar e modular as propriedades materiais do núcleo é induzir a sobre
expressão de Lamina A/C, uma proteína do envelope nuclear que confere rigidez aos núcleos. Por sua
vez, a rigidez do núcleo está inversamente relacionada com a deformabilidade nuclear. Assim, núcleos
com níveis menores de Lamina A/C têm tipicamente uma menor rigidez nuclear, tendo uma maior
capacidade de alterar a sua forma. Estudos comparativos, entre núcleos com diferentes níveis de Lamina
A/C permitem-nos avaliar o impacto da deformabilidade nuclear em diferentes fenómenos biológicos.
Num estudo publicado pelo nosso laboratório foi reportado que os neuroepitélios da retina e do
rombencéfalo expressam apenas baixos níveis de Lamina A. Posto isto, comparou-se a migração de
núcleos controlo com níveis endógenos de Lamina A e núcleos em que a sobre-expressão de Lamina A
foi induzida. Verificou-se que sobre-expressão de Lamina A no epitélio pseudoestratificado precursor
da retina do peixe zebra provoca um atraso na duração da migração para a parte apical. Enquanto
núcleos controlo demoram em média cerca de 20 minutos, núcleos que sobre-expressam Lamina A,
demoram cerca de 30.
Dado que a retina é um tecido com uma densidade celular elevada e cujas células exibem
movimentos nucleares bastante dinâmicos, considerámos a hipótese de que os baixos níveis endógenos
de Lamina A permitissem uma elevada deformabilidade nuclear, assegurando uma migração eficiente
através de tecidos altamente congestionados.
Para avaliar esta hipótese procedemos a uma caracterização inicial do nosso sistema. Como tal,
fizemos um Western Blot para confirmar e caracterizar a dinâmica temporal da sobre-expressão de
Lamina A, induzida por choque térmico. Tendo confirmado a sobre-expressão de Lamina A e
garantindo que os seus níveis perduravam durante o período experimental, decidimos avaliar se esta
interferia com a localização de actina durante a migração nuclear. Observámos que a actina localiza imediatamente abaixo de núcleos com sobre-expressão de
Lamina A, tal como previamente descrito para núcleos controlo. Isto indicou-nos que o mecanismo
responsável pela translocação do núcleo para a parte apical não é afetado pela sobre-expressão de
Lamina A e, por outro lado, sugeriu que o atraso observado nesta condição seria causado por outro
fator.
Decidimos então realizar uma caracterização inicial da forma nuclear, comparando núcleos
controlo com núcleos sobre-expressando Lamina A. Percebemos que núcleos que sobre-expressam esta
proteína escalam para tamanhos menores a apresentam formas menos variáveis. Isto indiciou que, tal
como referido na literatura, a sobre-expressão de Lamina A diminui a deformabilidade dos núcleos do
epitélio que origina a retina.
Com o objetivo de perceber se existe uma associação entre a deformabilidade nuclear e a
migração, procedemos a uma quantificação da deformabilidade em períodos de migração ativa e passiva
em núcleos controlo e com sobre-expressão de Lamina A. Para isso, fizemos reconstruções 3D de
núcleos da retina durante 20 min de migração ativa em G2 e quando os movimentos são estocásticos,
na fase S. Em conjunto com os nossos colaboradores, utilizámos estes dados para caracterizar a forma
dos núcleos. A nível mecânico, percebeu-se que os núcleos da retina podem ser definidos como
“gotículas comprimíveis”.
Para quantificar a deformabilidade, calculámos um parâmetro que usamos como proxy das
deformações nucleares, o RMSD (Root Mean Square Deviation). Este parâmetro indica-nos quanto é
que a forma nuclear se desvia da forma de uma elipsoide perfeita com a qual é comparada. Descobrimos
que, quando comparados com núcleos controlo, núcleos que sobre-expressam Lamina A apresentam
RMSDs mais baixos, tanto em G2 como na fase S, indicando que a sua forma se aproxima mais de
forma de uma elipsoide perfeita. A análise comparativa da amplitude da variação de RMSD é também
informativa uma vez que é reveladora das alterações de forma experienciadas pelo núcleo ao longo do
período segmentado, pelo que considerámos este parâmetro, um proxy da deformabilidade. Assim,
verificámos que os núcleos controlo em migração ativa exibem mais deformações que os que expressam
Lamina A. Este aumento das deformações específico de G2, em que a migração é ativa, sugere que as
deformações nucleares podem facilitar a migração através tecidos com uma densidade celular elevada,
como é o caso da retina em desenvolvimento.
De modo a averiguar se este fenómeno é dependente das características do tecido,
caracterizámos as deformações nucleares no rombencéfalo, um epitélio pseudoestratificado com menor
densidade celular. Contrariamente ao observado na retina, o RMSD dos núcleos que sobre-expressam
Lamina A, não se distingue de núcleos controlo por apresentarem valores mais baixos, mostrando que
as deformações observadas são equivalentes em ambas as condições. Além disso, quando comparamos
a amplitude da variação do RMSD, proxy da deformabilidade nuclear, na fase S e G2, não verificamos
um aumento significativo da deformabilidade nos núcleos controlo em G2. Estes resultados sugeremnos que a deformabilidade facilita a migração nuclear ativa e que esse fenómeno depende da densidade
celular do tecido.
Sendo a migração nuclear para a parte apical da célula uma etapa tão crucial para a correta
morfogénese da retina, decidimos explorar se o atraso na migração de núcleos que sobre-expressam
Lamina A impacta negativamente a neurogénese das células da retina. Como tal, avaliámos a expressão
de Ath5, um marcador de neurogénese em células com sobre-expressão de Lamina A. Concluímos que
não só as células marcadas expressam Ath5 como localizam nas devidas camadas neuronais da retina,
não indiciando por isso, quaisquer problemas de desenvolvimento no órgão. O mesmo foi sugerido pela
avaliação da formação das diferentes camadas neuronais.
O estudo das propriedades que facilitam a migração nuclear é muito importante uma vez que
este processo está envolvido numa miríade de fenómenos celulares e de desenvolvimento. Sendo o núcleo o maior organelo na maior parte das células é também um fator limitante no que concerne à
migração por espaços apertados. As propriedades físicas do núcleo que permitem a migração através de
espaços apertados têm sido bastante estudadas em sistemas in vitro. Neste estudo, explorámos esta
questão num organismo em desenvolvimento, alavancando uma comparação da deformabilidade
nuclear entre diferentes condições e tecidos. Para isso estabelecemos uma forma reprodutível de
quantificar as migrações nucleares que poderá ser aplicada noutros contextos biológicos. Com isto,
concluímos que a deformabilidade nuclear é relevante para a migração, particularmente em tecidos
congestionados, como é o caso do neuroepitélio precursor da retina. No entanto, verificámos que um
atraso na migração nuclear apical não afeta a neurogénese, o que realça a grande robustez deste
fenómeno.
Pseudostratified epithelia are diverse tissues seen in developing invertebrates and vertebrates that are composed of a monolayer of cells and serve as precursors of several organs. A hallmark of PSE is the migration of nuclei to the apical side of the cell before mitosis. This apical movement is required for tissue integrity and its maturation. As PSE are highly proliferative tissues, nuclei become increasingly packed throughout development, reducing the space for apical nuclear migration. While the cytoskeletal elements driving apical nuclear migration are well understood, the potential role of the nuclei's intrinsic properties in facilitating this movement remains less explored. Our lab has shown that nuclei that overexpress Lamin A are stiffer and take longer to undergo apical nuclear migration within the retinal PSE. Interestingly, Lamin A is typically expressed at low levels at early developmental stages in PSE. We thus hypothesized that these naturally low levels of Lamin A mean that nuclei are more deformable, as they are less stiff, which in turn facilitates the efficient movement of nuclei through the densely packed tissue. To test this idea, we established a pipeline to analyse nuclear shape changes and quantitatively assess nuclear deformations from live imaging videos. We also compared nuclear deformations during nuclear migration in two differently packed tissues, the retina and hindbrain. This revealed that nuclei deform more during active migration in densely packed tissues, indicating a tissue-dependent role of nuclear deformations. Notably, despite the impaired deformability of nuclei in cells overexpressing Lamin A, neurogenesis was not impacted, indicating that apical nuclear migration remains robust. Our findings suggest that nuclear deformability is relevant for efficient nuclear migration depending on tissue context and most important, within constrained environments such as crowded and dynamic developing tissues.
Pseudostratified epithelia are diverse tissues seen in developing invertebrates and vertebrates that are composed of a monolayer of cells and serve as precursors of several organs. A hallmark of PSE is the migration of nuclei to the apical side of the cell before mitosis. This apical movement is required for tissue integrity and its maturation. As PSE are highly proliferative tissues, nuclei become increasingly packed throughout development, reducing the space for apical nuclear migration. While the cytoskeletal elements driving apical nuclear migration are well understood, the potential role of the nuclei's intrinsic properties in facilitating this movement remains less explored. Our lab has shown that nuclei that overexpress Lamin A are stiffer and take longer to undergo apical nuclear migration within the retinal PSE. Interestingly, Lamin A is typically expressed at low levels at early developmental stages in PSE. We thus hypothesized that these naturally low levels of Lamin A mean that nuclei are more deformable, as they are less stiff, which in turn facilitates the efficient movement of nuclei through the densely packed tissue. To test this idea, we established a pipeline to analyse nuclear shape changes and quantitatively assess nuclear deformations from live imaging videos. We also compared nuclear deformations during nuclear migration in two differently packed tissues, the retina and hindbrain. This revealed that nuclei deform more during active migration in densely packed tissues, indicating a tissue-dependent role of nuclear deformations. Notably, despite the impaired deformability of nuclei in cells overexpressing Lamin A, neurogenesis was not impacted, indicating that apical nuclear migration remains robust. Our findings suggest that nuclear deformability is relevant for efficient nuclear migration depending on tissue context and most important, within constrained environments such as crowded and dynamic developing tissues.
Description
Tese de Mestrado, Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências
Keywords
Deformabilidade nuclear Lamina A Epitélio pseudoestratificado Peixe-zebra Imaging quantitativo Teses de mestrado - 2024