Trigger ferroptosis in breast cancer (BC) cells by targeting xCT and FATP1

Abreu, Bruna de Lara

http://hdl.handle.net/10400.5/95676

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Authors

Abreu, Bruna de Lara

Advisor(s)

Serpa, Jacinta

Carlos, Ana Rita Cabral Martins

Abstract(s)

O carcinoma da mama (BC) afeta milhões de pessoas no mundo e apesar das melhorias na terapêutica e abordagem clínica, continua a constituir um grave problema clínico. Esta doença divide-se em três subtipos moleculares, o BC do tipo luminal, que expressa o recetor de estrogénio e/ou progesterona, o BC enriquecido com HER2, que apenas expressa o recetor do fator do crescimento epidermóide 2, e o BC do tipo triplo negativo (TNBC), se não expressar nenhum destes recetores. Este último é o carcinoma com o fenótipo mais agressivo e com uma maior taxa de mortalidade entre os subtipos de BC. Isto devese parcialmente ao facto de não existirem terapias alvo e ao desenvolvimento de resistência à terapêutica convencional. Um melhor conhecimento dos mecanismos subjacentes à biologia da doença pode ajudar a identificar novos marcadores e alvos terapêuticos. Sabe-se que, apesar de ser uma doença multifatorial, todas as células malignas partilham características comuns, as hallmarks do cancro. Neste contexto, o estudo do metabolismo tumoral ocupa um lugar privilegiado. As células malignas sofrem remodelação metabólica, de forma a sustentar a elevada capacidade proliferativa e de biossíntese. Esta remodelação promove a adaptação ao microambiente tumoral e à biodisponibilidade de nutrientes. Assim, as células cancerígenas expressam transportadores que medeiam a importação de compostos orgânicos do meio extracelular. Vários estudos mostram que o metabolismo da cisteína e dos ácidos gordos contribuem para a progressão do BC. A cisteína é um aminoácido essencial, cuja importação é feita através do transportador xCT, que o nosso grupo descreveu estar sobreexpresso em linhas celulares e amostras humanas de TNBC. A cisteína no interior da célula é utilizada para sintetizar a glutationa, que é biologicamente muito relevante, pois é um cofator de várias enzimas antioxidantes e destoxificantes, nomeadamente, a glutationa peroxidase 4, que protege as células de danos por peroxidação lipídica. Os ácidos gordos desempenham várias funções no interior da célula, sendo uma fonte de energia, constituintes de membranas, e moléculas de sinalização. A sua importação é feita através de vários transportadores, nomeadamente o FATP1 que também está associado à biossíntese de gotas lipídicas (LD). Estas são organelos intracelulares de ácidos gordos, que capturam os lípidos não esterificados no seu interior, na sua forma neutra, protegendo as células da formação de peróxidos lipídicos, e ainda os libertam controladamente consoante as necessidades energéticas das células. Estudos prévios realizados pelo nosso grupo demonstraram que linhas celulares e amostras humanas de TNBC apresentam expressão aumentada de FATP1. O xCT e a formação de LD são inibidores da ferroptose, que é uma morte celular provocada pela acumulação de peróxidos lipídicos, devido à geração de radicais livres relacionados com iões ferro. Assim, este projeto tem o objetivo de explorar se a inibição do xCT e do FATP1 poderá ser uma abordagem terapêutica viável em BC, promovendo a ferroptose. A inibição do xCT e do FATP1 foi realizada com selénio-crisina (SeChry) e arilpiperazina 5k, respetivamente. Para os modelos in vitro utilizou-se quatro linhas celulares que representam diferentes subtipos moleculares de BC, as MCF7 e BT474 do subtipo molecular luminal, e as HCC1806 e MDA-MB-231 do subtipo TNBC. Para a observação dos efeitos do SeChry e do 5k in vivo, foi desenvolvido um modelo xenógrafo ortotópico murino, usando as células MDA-MB-231. As linhas celulares foram expostas ao SeChry, ao 5k, e à combinação dos dois, durante 24 h. Os ratinhos foram tratados com SeChry encapsulado num dendrímero de poliureia funcionalizado com ácido fólico (SeChry@PUREG4-FA2), para reduzir a toxicidade sistémica, sendo mais específico para as células tumorais, visto que estas sobreexpressam o recetor do folato. O tratamento desenrolou-se ao longo de 2 semanas com 2 aplicações a cada 3 dias, sendo o SeChry@PUREG4-FA2 administrado no tumor e o 5k no peritoneu. In vitro, caracterizaram-se os efeitos do SeChry e do 5k com ensaios de morte com anexina-V e iodeto de propídio (PI) por citometria de fluxo. Foi demonstrado, que as células quando expostas a concentrações crescentes de SeChry tinham um aumento significativo de morte celular. Com estes resultados também se determinou as concentrações de EC50 para este composto, onde se obteve que as células mais sensíveis são as MDA-MB-231, seguidas das MCF7, BT474 e HCC1806. Porém, o 5k não apresentou um efeito citotóxico significativo. A expressão do xCT e FATP1 basal e na presença dos inibidores foi avaliada por imunofluorescência indireta. Observou-se que todas as linhas celulares expressavam ambos os inibidores, e que a expressão do FATP1 diminuiu quando as células eram postas em cultura com os inibidores. In vivo, o volume do tumor em ratinhos tratados com SeChry@PUREG4-FA2 foi significativamente menor comparado com o grupo não tratado, contudo, o tratamento conjunto com SeChry@PUREG4-FA2 e 5k não teve qualquer efeito no volume tumoral. Estes resultados confirmam a validade do xCT como alvo terapêutico e a eficácia do SeChry, e demonstram que o 5k protege as células do BC dos efeitos do SeChry. A ocorrência da ferroptose in vitro foi determinada por microscopia de fluorescência, para observar as LD, usando o corante Nile Red, e por citometria de fluxo para analisar os níveis citoplasmáticos de espécies reativas de oxigénio (ROS) e de peróxidos lipídicos, usando as sondas DCF-DA e Bodipy 581/591 C11, respetivamente. Nas linhas celulares de BC expostas a SeChry e 5k, observou-se um decréscimo na formação de LD e nos níveis de ROS intracelulares, com um aumento concomitante dos níveis de peróxidos lipídicos, sugerindo que está a ocorrer ferroptose. Visto que o 5k impediu os efeitos do SeChry@PUREG4-FA2 nos tumores dos ratinhos, levantou-se a hipótese que a morte por ferroptose ocorre proporcionalmente aos lípidos presentes no ambiente intracelular, e a absorção de lípidos pelas células depende da disponibilidade destes no microambiente, algo que foi demonstrado em estudos anteriores. Para testar esta teoria, repetiram-se ensaios de morte e análises de peróxidos lipídicos, em que as células de BC foram expostas ao SeChry, 5k e SeChry + 5K, cultivadas na presença ou ausência de ácido linoleico (C18:2). Observou-se uma diminuição de viabilidade celular compatível com a acumulação de peróxidos lipídicos nas linhas celulares de TNBC quando expostas a um ambiente rico em ácidos gordos. Estes resultados revelam que as células de TNBC que correspondem ao subtipo de BC com pior prognóstico são as mais suscetíveis a este tipo de morte celular. Secções congeladas dos tumores de ratinhos foram analisadas por histoquímica com Nile red e Bodipy 581/591 C11, para avaliar a presença de LD e peróxidos lipídicos, respetivamente. Observou-se que os tumores dos ratinhos tratados com SeChry@PUREG4-FA2 apresentavam evidências de ferroptose. Verificou-se uma diminuição da produção de LD nos tumores de ratinhos tratados com SeChry@PUREG4-FA2 e SeChry@PUREG4-FA2 + 5k. Contudo, o aumento dos níveis de peróxidos lipídicos apenas se verificou nos tumores dos ratinhos tratados com SeChry@PUREG4-FA2, o que justifica o volume reduzido dos tumores. Estes resultados permitem concluir que o 5k de facto protege as células de BC da ferroptose induzida pelo SeChry. Adicionalmente, com o objetivo de caracterizar os efeitos do SeChry@PUREG4-FA2 in vitro, determinou-se a concentração de EC50 para as linhas celulares através de ensaios de morte. A expressão do recetor de folato for avaliada por imunofluorescência indireta e confirmou-se que todas as linhas celulares de BC expressam este recetor. Num ensaio de comparação equimolar, avaliou-se o potencial diferencial anti-cancerígeno do SeChry (SeChry@PUREG4-FA2), do selénio (Se@PUREG4-FA2) e da crisina (Chry@PUREG4-FA2) encapsulados na nanopartícula. Todas as linhas celulares apresentaram respostas diferentes, mas em suma ambos o SeChry@PUREG4-FA2 e a Chry@PUREG4-FA2 foram eficazes a induzir morte celular. Para concluir, este trabalho reforça que as células de BC dependem do metabolismo da cisteína para controlo do stress oxidativo e que os ácidos gordos contribuem para a biologia da doença. Assim, a inibição de xCT com o SeChry poderá ser uma estratégia eficaz de tratamento de BC, sendo o mecanismo de ação mais provável a indução de ferroptose.

Breast cancer (BC) affects millions of people worldwide. A better understanding of BC biology, including metabolic remodeling of malignant cells, can aid in identifying new biomarkers and therapeutic targets. Our team disclosed the relevance of fatty acids in BC to sustain bioenergetics and biosynthesis, and the role of cysteine reliance in metabolism and redox control. This project aimed to explore whether disturbing fatty acid and cysteine uptake would induce ferroptosis, a form of cell death involving the accumulation of lipid peroxidation, in BC. This was tested by inhibiting the transporters FATP1 and xCT with 5k arylpiperazine and selenium-chrysin (SeChry), in BC cell lines from different molecular subtypes and in in vivo BC mouse models. In vitro, cell death was assessed by flow cytometry using annexin-V-FITC and propidium iodide labeling, and the levels of lipid droplets (LD), reactive oxygen species (ROS), and lipid peroxides were assessed by cytochemical stains and fluorescence microscopy. SeChry, but not 5k, increased cell death, accompanied by decreased accumulation of LD and ROS and increased levels of lipid peroxides, which is compatible with ferroptosis. Moreover, in a fatty acid-enriched environment, SeChry and 5k induced higher cell death in TNBC cell lines compared with luminal cell lines. It was also confirmed that SeChry is the best option for BC cells, since it induced significant cell death in all BC cell lines, while selenium presented significant toxicity in MDA-MB-231 cells, and chrysin was more toxic to BT474 and HCC1806 cells than SeChry. In vivo, SeChry significantly reduced the tumor volume, but 5k inhibited the effect of SeChry. These results were underlined by ferroptosis activation upon SeChry and ferroptosis inhibition upon 5k, due to decreased accumulation of LD and ultimately decreased lipid peroxidation. This work reinforces SeChry as a therapeutic opportunity to tackle metabolism and improve the clinical management of BC.