Caracterização molecular de genes associados a ciliopatias em homens com astenozoospermia por sequenciação de nova geração

Abstract

As ciliopatias são doenças hereditárias clinicamente e geneticamente heterogéneas, caracterizadas por disfunção ciliar. A patologia discinesia ciliar primária (PCD, primary ciliary dyskinesia) resulta de defeitos em cílios móveis, e pode apresentar manifestações como depuração mucociliar defetiva, situs inversus e reduzida motilidade de espermatozoides (astenozoospermia). Esta rara ciliopatia, de difícil diagnóstico, está associada a mais de 45 genes. Como tal, a validação da caracterização molecular de múltiplos genes por sequenciação de nova geração (NGS, next-generation sequencing) é essencial para o diagnóstico e investigação desta doença. Simultaneamente, procurou-se avaliar a associação entre astenozoospermia e 8 genes tradicionalmente associados a PCD. Os genes DNAAF2, DNAH5, DNAH11, DNAI1, DNAI2, NME8, RSPH9 e RSPH4A (223 exões) foram analisados em 48 homens diagnosticados com astenozoospermia, utilizando a plataforma de NGS MiSeq e a metodologia Ampliseq (Illumina). Recorreu-se à sequenciação de Sanger para a avaliação de regiões com cobertura vertical inferior a 20x. A anotação de variantes incluiu as ferramentas VarAFT, Variant Interpreter, HGMD, Alamut Visual-Plus, VarSome, ClinVar, HSF e IGV. Foram identificadas 57 variantes, em 47 dos 48 doentes, incluindo 9 de significado clínico desconhecido (VUS, variant of unknown significance), 2 provavelmente patogénicas e 1 patogénica. Destacam-se as VUS DNAH11:c.2909A>G e DNAH11:c.9935A>T, possivelmente presentes em trans (heterozigotia composta) num homem com oligoastenozoospermia, e DNAH5:c.3614C>T e DNAAF2:c.2239G>A, uma dupla heterozigotia detetada num doente com oligoastenoteratozoospermia. Adicionalmente, as variantes DNAH11:c.8990G>A e DNAH11:c.10739G>A, identificadas em 2 homens oligoastenozoospérmicos e classificadas como benignas, apresentam classificação oposta na literatura disponível (patogénicas). Contudo, não tendo sido possível estabelecer uma correlação causal direta entre o genótipo e o fenótipo de cada doente, estima-se que os genes analisados não constituam a principal base molecular de astenozoospermia isolada. Ainda assim, serão necessários estudos funcionais e familiares futuros para se poder classificar a patogenicidade destas variantes e compreender melhor o seu impacto na motilidade dos espermatozoides.

Ciliopathies are clinically and genetically heterogeneous hereditary diseases, characterized by ciliary disfunction. Primary ciliary dyskinesia (PCD), in particular, results from defects in motile cilia and, therefore, causes defective muco-ciliary clearance, situs inversus and reduced spermatozoa motility (asthenozoospermia). This rare ciliopathy with a challenging diagnosis is currently associated with over 45 genes. As such, validation of next-generation sequencing based panels to identify genetic variants is essential for the diagnosis and research of this disorder. Simultaneously, this study aimed to evaluate the association between asthenozoospermia and a panel of 8 genes related to PCD. The genes DNAAF2, DNAH5, DNAH11, DNAI1, DNAI2, NME8, RSPH9 and RSPH4A (223 exons) were analyzed in a group of 48 asthenozoospermic men, using Illumina’s MiSeq platform and Ampliseq methodology. Additionally, Sanger sequencing was employed for the evaluation of regions of interest with depth coverage below 20x. Variants annotation involved several bioinformatics tools, including VarAFT, Variant Interpreter, HGMD, Alamut Visual Plus, VarSome, ClinVar, HSF and IGV. 57 variants were identified in 47 out of the 48 patients, including 1 pathogenic, 2 likely pathogenic, and 9 variants of uncertain significance (VUS). Some VUS are of particular interest, namely DNAH11:c.2909A>G and DNAH11:c.9935A>T, probably present in trans (compound heterozygosity) in an oligoasthenozoospermic man, and DNAH5:c.3614C>T and DNAAF2:c.2239G>A, a double heterozygosity detected in a patient with oligoasthenoteratozoospermia. Furthermore, the variants DNAH11:c.8990G>A and DNAH11:c.10739G>A, identified in 2 oligoasthenozoospermic men and described as benign, display contradictory information in the available literature (pathogenic). However, the impossibility of establishing a direct correlation between the genotype and the phenotype of each patient, led us to infer that the 8 genes analyzed are unlikely to constitute the principal molecular base of isolated asthenozoospermia. Even so, future functional and family studies are required in order to properly classify these variants and better understand their impact on spermatozoa motility.