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Publicação
Olea europaea: biological potential of an ancient tree
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Autores
Resumo(s)
A oliveira é uma árvore milenar com um elevado valor cultural e socioeconómico nos países mediterrânicos, sendo Portugal um dos maiores produtores e consumidores de azeite e azeitonas de mesa. Ao longo dos últimos anos tem-se observado uma crescente procura global de azeite, levantando questões sobre a valorização dos diferentes subprodutos da sua cadeia de produção, com o objetivo de promover uma economia circular. Neste sentido, o perfil fitoquímico e as atividades biológicas dos produtos e subprodutos da oliveira, tais como as folhas e o bagaço de azeitona têm sido amplamente estudados. No entanto, pouco se sabe sobre os caroços e as sementes de azeitona.
Neste trabalho, procedeu-se à caracterização química dos extratos lipídicos e polares de caroços de azeitona e à avaliação das atividades antioxidante, antimicrobiana e ani tumoral dos extratos polares. A caracterização nutricional dos caroços de azeitona foi igualmente realizada verificando-se que são constituídos maioritariamente por hidratos de carbono (86,00 ± 28,00 % de peso seco) e fibra alimentar (42,20 ± 8,40 % de peso seco), enquanto outros componentes como proteína (1,20 ± 0,10 de peso seco), gordura (0,90 ± 0,20 de peso seco) e cinzas (0,58 ± 8,40 de peso seco) se encontram numa percentagem muito mais reduzida.
Os extratos das frações lipídicas foram obtidos pelos métodos de Folch e Soxhlet utilizando como solventes uma mistura de metanol/clorofórmio e n-hexano, respetivamente. Estes extratos apresentaram rendimentos mássicos de extração de 0,98 ± 0,06 (método de Folch) e 0,93 ± 0,09 % (método de Soxhlet). Posteriormente foi realizada a derivatização dos ácidos gordos nos seus respetivos ésteres metílicos (FAMEs), seguida de análise por cromatografia gasosa com um detetor de ionização de chama. Foram identificados quatro FAMEs exclusivos ao extrato de Soxhlet (correspondentes aos ácidos cis-7 palmitoleico, cis-5 eicosenoico, eicosadienoico e docosadienoico) e apenas um FAME exclusivo ao extrato de Folch (correspondente ao ácido vaccénico). Para além disso, grande parte dos ácidos gordos identificados no extrato de Soxhlet apresentaram concentrações mais elevadas quando comparados com o extrato de Folch. Em ambos os extratos, o ácido oleico apresentou a concentração mais elevada (349,30 ± 24,54 e 194,73 ± 8,58 μg/mg extrato para os métodos de Soxhlet e Folch, respetivamente), seguido pelo ácido palmítico (89,22 ± 4,55 e 62,71 ± 2,18 μg/mg extrato para os métodos de Soxhlet e Folch, respetivamente) e pelo ácido linoleico (59,86 ± 3,95 e 28,12 ± 0,87 μg/mg extrato para os métodos de Soxhlet e Folch, respetivamente). Em ambos os extratos foi determinada uma concentração mais reduzida de ácidos gordos saturados quando comparada com os ácidos gordos insaturados. No que toca ao perfil de ácidos gordos insaturados, a concentração de ácidos gordos monoinsaturados foi superior à de polinsaturados.
Para a preparação dos extratos ricos em compostos polares foram usados dois métodos: extração convencional (CE) com metanol 80% (V/V), com e sem pré-tratamento da amostra assistida por micro-ondas (MASP); e extração assistida por micro-ondas (MAE), utilizando dois rácios diferentes de solvente/matéria-prima (20 e 4), três solventes (água, etanol e metanol) e quatro misturas aquosas de metanol e etanol. Estes extratos foram analisados por cromatografia líquida de alta eficiência com detetores de matriz de díodos, fluorescência e eletroquímico (HPLC-DAD-FLD-ECD). O conteúdo em fenóis totais (TPC) foi determinado através dos cromatogramas obtidos a 280 nm.
Nos extratos obtidos por MAE, o uso de um rácio solvente/matéria-prima menor permitiu que fossem extraídas menores quantidades de compostos não-fenólicos, visto que os rendimentos mássicos foram inferiores e os valores de TPC por grama de extrato determinados foram mais elevados comparativamente aos obtidos para um rácio de 20. Para além disto, o uso de misturas aquosas de solventes em MAE levou geralmente a valores mais elevados de TPC por grama de extrato. Comparando os métodos de MAE e CE, os extratos de MAE são mais ricos em compostos fenólicos, porém ambos os métodos foram igualmente eficientes na sua extração.
Estes extratos foram ainda analisados por HPLC-DAD-MS/MS. Foi identificado um maior número de compostos nos extratos obtidos por MAE usando MeOH 50% (V/V) e EtOH 80% e 50% (V/V) como solvente, em comparação com CE sem MASP. Os extratos obtidos por CE com MASP apresentaram um número mais reduzido de compostos identificados em comparação com CE sem MASP. Os extratos obtidos por MAE usando água e EtOH 50% (V/V) foram aqueles em que se identificaram o menor e maior número de compostos, respetivamente. Os secoiridoides nüzhenido e a oleuropeína, e os fenilpropanoides verbascosido e salidrosido foram identificados em todos os extratos.
A atividade antioxidante foi avaliada pelos ensaios ORAC e HOSC. Os extratos obtidos por MAE com as misturas aquosas de metanol e etanol apresentaram maior atividade antioxidante. Nestes extratos, os valores de HOSC apresentaram uma correlação positiva com os valores de TPC/g de extrato, no entanto o mesmo apenas foi observado para os valores de ORAC quando foi excluído o extrato obtido com água. Quando comparados com a CE, os valores de HOSC obtidos nos extratos obtidos por MAE foram também superiores, evidenciando a eficácia deste método na extração de bioativos de caroços de azeitona. A utilização do MASP não apresentou nenhum benefício aparente na extração, uma vez que foram obtidos valores semelhantes de TPC e atividade antioxidante quando comparados com a CE sem MASP.
Foi realizado um scale-up do método MAE utilizando os solventes considerados mais promissores (EtOH 50% (V/V), MeOH 50% (V/V) e MeOH 80% (V/V)), obtendo-se extratos com valores de TPC e ORAC semelhantes aos alcançados anteriormente. Estes extratos foram reconstituídos em etanol e a sua fração solúvel neste solvente foi utilizada nos ensaios de atividade biológica. O extrato obtido usando MeOH 50% (V/V) apresentou uma fração significativamente insolúvel em etanol, inviabilizando o prosseguimento dos ensaios biológicos.
A citotoxicidade e a atividade antiproliferativa foram avaliadas em duas linhas celulares humanas derivadas de tumores colorretais, Caco-2 e HT-29. Foi determinado que concentrações entre 0 e 0,63 mg de extrato/mL não apresentaram efeito citotóxico nas células Caco-2 e concentrações iguais ou superiores a 0,63 mg de extrato/mL apresentaram efeito anti proliferativo em células HT-29. Ambos os extratos apresentaram uma citotoxicidade semelhante. Além disso, o extrato obtido com etanol 50% (V/V) apresentou uma melhor atividade anti proliferativa (EC50 = 0,120 ± 0,024 mg de extrato/mL) quando comparado àquele obtido usando metanol 80% (V/V) (EC50 = 0,178 ± 0,023 mg de extrato/mL).
Foram ainda realizados ensaios de suscetibilidade antimicrobiana contra quatro microrganismos: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Candida albicans e Aspergillus brasiliensis. Os extratos não inibiram o crescimento microbiano, embora tenha sido observada uma pequena redução no crescimento em S. aureus para ambos os extratos.
Os resultados apresentados nesta tese estabelecem uma base sólida para a investigação contínua sobre métodos de extração mais sustentáveis. Realçam igualmente o potencial dos extratos de caroço de azeitona, nomeadamente ao nível dos seus perfis de ácidos gordos e compostos fenólicos, para futura valorização e potenciais aplicações terapêuticas.
The increasing global demand for olive oil highlights the need of valorising its by-products. While the phytochemical profile and biological activities of some by-products, such as olive leaves and pomace have been studied, olive stones remain largely unexplored. This thesis aimed to fulfil this gap. Nutritional characterization revealed that olive stones primarily consist of carbohydrates and alimentary fiber, with minor amounts of protein, fat and ash. Lipid extracts were obtained by Soxhlet and Folch methods. Fatty acids were derivatized into fatty acid methyl esters (FAMEs) and analysed by GC-FID. The Soxhlet extract contained a wider range of compounds and higher concentrations of major FAMEs, with oleic acid as the predominant compound, followed by palmitic acid and linoleic acids. Polar extracts were obtained using two methods: conventional extraction (CE) using methanol 80% (V/V), with and without microwave-assisted sample pretreatment (MASP), and by microwave assisted extraction (MAE), using two solvent/sample ratios (20 and 4), three solvents and four aqueous mixtures of methanol and ethanol. HPLC-DAD-FLD-ECD analysis showed that both extraction methods were equally effective for phenolic compound extraction. However, MAE yielded higher values of TPC per gram of extract. Further HPLC-DAD-MS/MS analysis identified phenolic compounds such as the secoiridoids nüzhenide, oleuropein, and the phenylpropanoid glycosides verbascoside and salidroside. Antioxidant activity (AOA) was evaluated by ORAC and HOSC assays. MAE solvent mixtures presented higher AOA, compared to CE. HOSC values indicated that the microwave assisted extraction is more effective for phenolics extraction than CE, and MASP did not enhance extraction efficiency (similar AOA and TPC to CE without MASP). A scale-up of the MAE method using the most promising solvents (EtOH 50% (V/V), and MeOH 50% and 80% (V/V)) produced extracts with similar ORAC values to those previously obtained. The cytotoxicity and antiproliferative activity were evaluated on Caco-2 and HT-29 human cell lines derived from colorectal tumours. Concentrations between 0 – 0.63 mg extract/mL showed no cytotoxicity on Caco-2 cells and concentrations of 0.63 mg extract/mL and above exhibited antiproliferative effects against HT-29 cells. The EtOH 50% (V/V) extract showed a better antiproliferative effect. The antimicrobial susceptibility was evaluated against four different microorganisms. Although microbial growth was not inhibited, a slight reduction in S. aureus growth was observed. The results presented in this thesis establish a solid foundation for continued research into more sustainable extraction methods. They also highlight the potential of olive stone extracts, particularly in terms of their fatty acid and phenolic compound profiles, for future valorisation and potential therapeutic applications.
The increasing global demand for olive oil highlights the need of valorising its by-products. While the phytochemical profile and biological activities of some by-products, such as olive leaves and pomace have been studied, olive stones remain largely unexplored. This thesis aimed to fulfil this gap. Nutritional characterization revealed that olive stones primarily consist of carbohydrates and alimentary fiber, with minor amounts of protein, fat and ash. Lipid extracts were obtained by Soxhlet and Folch methods. Fatty acids were derivatized into fatty acid methyl esters (FAMEs) and analysed by GC-FID. The Soxhlet extract contained a wider range of compounds and higher concentrations of major FAMEs, with oleic acid as the predominant compound, followed by palmitic acid and linoleic acids. Polar extracts were obtained using two methods: conventional extraction (CE) using methanol 80% (V/V), with and without microwave-assisted sample pretreatment (MASP), and by microwave assisted extraction (MAE), using two solvent/sample ratios (20 and 4), three solvents and four aqueous mixtures of methanol and ethanol. HPLC-DAD-FLD-ECD analysis showed that both extraction methods were equally effective for phenolic compound extraction. However, MAE yielded higher values of TPC per gram of extract. Further HPLC-DAD-MS/MS analysis identified phenolic compounds such as the secoiridoids nüzhenide, oleuropein, and the phenylpropanoid glycosides verbascoside and salidroside. Antioxidant activity (AOA) was evaluated by ORAC and HOSC assays. MAE solvent mixtures presented higher AOA, compared to CE. HOSC values indicated that the microwave assisted extraction is more effective for phenolics extraction than CE, and MASP did not enhance extraction efficiency (similar AOA and TPC to CE without MASP). A scale-up of the MAE method using the most promising solvents (EtOH 50% (V/V), and MeOH 50% and 80% (V/V)) produced extracts with similar ORAC values to those previously obtained. The cytotoxicity and antiproliferative activity were evaluated on Caco-2 and HT-29 human cell lines derived from colorectal tumours. Concentrations between 0 – 0.63 mg extract/mL showed no cytotoxicity on Caco-2 cells and concentrations of 0.63 mg extract/mL and above exhibited antiproliferative effects against HT-29 cells. The EtOH 50% (V/V) extract showed a better antiproliferative effect. The antimicrobial susceptibility was evaluated against four different microorganisms. Although microbial growth was not inhibited, a slight reduction in S. aureus growth was observed. The results presented in this thesis establish a solid foundation for continued research into more sustainable extraction methods. They also highlight the potential of olive stone extracts, particularly in terms of their fatty acid and phenolic compound profiles, for future valorisation and potential therapeutic applications.
Descrição
Tese de mestrado, Qualidade Alimentar e Saúde, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.
Palavras-chave
Olive stone Phenolic compounds Fatty acids Antioxidant activity Antitumour activity. Teses de mestrado - 2024