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The metabolomics of fingermarks : a novel non-invasive method in biomedicine applied to obesity
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Autores
Orientador(es)
Resumo(s)
O metaboloma é o conjunto de todos os metabolitos, moléculas com peso molecular inferior a 1500 Da,
presentes num sistema biológico, e que incluem lípidos, aminoácidos, glúcidos, pequenos péptidos,
nucleótidos, drogas e compostos presentes no meio-ambiente. É uma entidade altamente dinâmica, de
grande diversidade química em constante mudança, regulada tanto por fatores internos, como o genoma,
idade, sexo e estado de saúde, como por fatores externos, como o meio-ambiente, a alimentação e o
estilo de vida. Assim, o metaboloma reflete, com grande proximidade, o fenótipo e fornece-nos uma
imagem detalhada, em tempo real, do nosso estado de saúde. A metabolómica tem consequentemente
um grande potencial para aplicações clínicas, nomeadamente para diagnóstico, monitorização e
avaliação do risco de desenvolvimento de doenças, uma vez que fornece um perfil mais detalhado e
informativo do doente, assim como um poder preditivo superior ao de outras ómicas, especialmente para
doenças multifatoriais. Esta hipótese é apoiada pelo crescente número de artigos a propor metabolitos
como candidatos a biomarcadores com valor de diagnóstico, monitorização e prognóstico de uma grande
variedade de doenças, incluindo obesidade, diabetes tipo 2, doença cardiovascular e cancro.
Como fortes crentes no poder da metabolómica para revolucionar a medicina, neste trabalho propomos
um método totalmente não invasivo baseado em metabolómica não direcionada de resíduos de
impressões digitais por FT-ICR MS. Os resíduos de impressões digitais são uma amostra biológica com
uma grande diversidade metabólica, que é formada quando os nossos dedos entram em contacto com
uma superfície. Na sua composição são encontrados diversos metabolitos endógenos, incluindo lípidos,
aminoácidos, pequenos péptidos e glúcidos, pelo que os resíduos de impressões digitais nos oferecem a
janela perfeita para o nosso metaboloma. A sua amostragem ao contrário da maioria dos métodos de
metabolómica clínica não causa qualquer desconforto ao doente, é bastante rápida, não requer muito
treino e a sua preparação para análise no espectrómetro de massa é mínima. Tudo isto torna o nosso
método muito vantajoso quando comparado com métodos tradicionais, como análises de plasma
sanguíneo, soro, lágrimas ou biópsias. Para além disso, a impressão digital de cada indivíduo tem um
perfil químico único influenciado pela sua genética, dieta, estilo de vida e estado de saúde, que pode ser
utilizada para monitorização personalizada do estado de saúde. Consequentemente, as impressões
digitais têm um enorme potencial para aplicações para o estudo de diversas doenças humanas.
A escolha de uma abordagem não direcionada e do uso de FT-ICR MS, cuja resolução é extrema, para a
análise do metaboloma dos resíduos das impressões digitais assegurou-nos uma visão do metaboloma o
mais abrangente possível e, consequentemente, uma maximização da recolha de informação biológica.
O uso deste tipo de espectrometria de massa possibilita a eliminação da separação da amostra por
cromatografia líquida, uma técnica morosa, usada pela maioria dos métodos de metabolómica clínica.
Alternativamente foi usada infusão direta, que aumenta a rapidez das análises e diminui os seus custos,
algo altamente desejável em qualquer método desenvolvido para uso clínico.
O desenvolvimento de métodos padronizados para recolha, armazenamento e análise de impressões
digitais é fundamental para garantir reprodutibilidade e permitir comparação de resultados entre estudos.
A recolha e o processamento das amostras foram adaptados de um método anterior desenvolvido no
nosso laboratório para fins forenses. Partindo deste método, realizámos vários passos de otimização, de
modo a maximizar a cobertura do metaboloma e a fração de compostos lipídicos e de aminoácidos
identificados. Estes incluíram otimização das condições de pré-amostragem, método de recolha, prétratamento, preparação da amostra e da análise de espectrometria de massa. Começámos por otimizar as
condições de pré recolha da amostra. Foram testados diferentes métodos de lavagem das mãos antes da
recolha, tendo sido o método de lavagem das mãos com água o que forneceu os melhores resultados.
Foi testado depois o pré-tratamento das amostras com dois métodos de extração líquido-líquido,
observando-se que um deles levou à obtenção de melhores resultados do que os obtidos na ausência de pré-tratamento. Várias combinações de solventes, agentes de protonação e NH4Ac em conjugação com
a análise por ESI+
e ESIe com ionização e dessorção a laser assistida por matriz em modo positivo
foram testadas. Os melhores resultados foram obtidos apenas com ESI+
e ESI-
. Por último, foram
testados os métodos de recolha de resíduos de impressões digitais, por deposição em lâmina de vidro ou
por contacto da ponta do dedo com a solução de extração. O método de recolha em lâmina de vidro
através do esfregaço foi o selecionado. Este método destaca-se pela simplicidade, rapidez e robustez
técnica. As amostras foram recolhidas numa lâmina de vidro de microscopia pelo esfregar dos dedos e
os metabolitos extraídos por lavagem dinâmica com uma mistura de MeOH: H2O 1:1. Os extratos
metabólicos foram depois pré tratados por extração líquido-líquido, pela adição sequencial de soluções
de MeOH: H2O 1:1, clorofórmio e clorofórmio: MeOH 3:1. As frações aquosa e orgânica foram
recolhidas e diluídas em ACN: H2O 1:1 com NH4AC para análise por ESI+
e em ACN: H2O 1:1 para
análise por ESI-
.
Uma vez provado que o método desenvolvido tinha um ótimo desempenho a nível técnico e era capaz
de fornecer informação biológica relevante, avançámos para a prova de conceito da aplicabilidade do
mesmo a nível biomédico e clínico, tendo sido utilizada a obesidade como modelo de estudo.
A obesidade é uma doença caracterizada pelo excesso de massa gorda e diagnosticada por um body mass
index (BMI) ≥ 30 kg/m2
. Atualmente é uma doença extremamente prevalente a nível mundial, com cerca
de 14% da população obesa e um aumento de 33% para sua prevalência previsto para 2030. Estes valores
são alarmantes, uma vez que a obesidade pode não só diminuir grandemente a qualidade de vida dos
doentes, como reduzir a sua esperança de vida, devido ao maior risco que estes têm para o
desenvolvimento de doenças cardiometabólicas e cancro. Como uma doença com grandes perturbações
metabólicas a si associadas e uma maior propensão para o desenvolvimento de doenças também elas
associadas a alterações de natureza metabólica, a obesidade foi o modelo perfeito para o nosso estudo.
Mais ainda, porque é necessário solucionar os problemas associados à utilização do BMI, a medida
atualmente mais utilizada por médicos para o diagnóstico e monitorização dos doentes obesos.
O BMI, quociente entre o peso e o quadrado da altura, é uma medida pouco informativa do estado de
saúde dos doentes obesos, tendo um fraco valor preditivo do risco de desenvolvimento de doenças
cardiometabólicas, com estudos a reportarem diferentes riscos para indivíduos com um mesmo BMI.
Adicionalmente, foi observado que alguns obesos nunca desenvolvem qualquer tipo de complicação
cardiometabólica ao longo das suas vidas, os chamados obesos metabolicamente saudáveis, e que
quando há coexistência, por exemplo, com doença cardiovascular ou diabetes tipo 2, a obesidade pode
ter um papel protetor, um fenómeno designado por paradoxo da obesidade.
Vários estudos reportaram diversas alterações metabólicas características da obesidade, resistência à
insulina, diabetes tipo 2, doença cardiovascular e inflamação crónica, particularmente a nível do
metabolismo lipídico e identificaram vários metabolitos candidatos a biomarcadores com valor
diagnóstico ou preditivo. Mais ainda, um estudo recente reportou o metaboloma como um melhor
preditor da ocorrência de doenças cardiovasculares comparativamente com o BMI.
Para a parte de prova de conceito do método, foram analisados os resíduos das impressões digitais de 5
doentes obesos e 5 doentes com peso normal. A aplicação de um modelo de hierarchical clustering, um
método de análise estatística multivariada não supervisionado que agrupa as amostras com maior
semelhança, confirmou a elevada reprodutibilidade do método. Para identificar alterações metabólicas
induzidas pela obesidade e os metabolitos mais diferencialmente expressos em doentes obesos e com
peso normal, um modelo de PLS-DA, um método estatístico de análise multivariada supervisionada, foi
aplicado e os VIP scores foram calculados. Os metabolitos endógenos identificados com fórmula e nome, e com um VIP score significativo (>1) foram considerados como relevantes para a diferenciação
entre os doentes obesos e os de peso normal.
Após a aplicação dos critérios de seleção, 43 metabolitos foram considerados como importantes para a
diferenciação entre os dois grupos de doentes, dos quais 41 foram identificados como compostos
lipídicos. Estes metabolitos pertencem a grupos muito diversos, incluindo esfingolípidos,
glicerofosfolípidos, diacilgliceróis, N-acil aminoácidos, monoacilgliceróis, derivados esteredoigénicos
e acilcolinas. Os compostos não lipídicos identificados foram o DHAP (6:0) e um pequeno péptido com
atividade neurológica, a dinorfina B. Técnicas complementares como MS/MS ou espectrometria de
massa acoplada a cromatografia líquida, seriam necessárias, para confirmar a identidade destes
metabolitos, uma vez que para vários dos valores de m/z, múltiplas fórmulas e/ ou metabolitos foram
anotados.
Ceramidas de 18 carbonos, alguns diacilgliceróis e espécies oxidadas de ácido fosfatídico,
fosfatidiletanolamina e fosfatidilglicerol forma identificados como possíveis candidatos a
biomarcadores para a avaliação do risco de desenvolvimento de doença cardiovascular, uma vez que
foram reportados na literatura níveis alterados destes metabolitos em indivíduos com doença
cardiovascular. Adicionalmente, as ceramidas e alguns dos diacilgliceróis foram identificados como
possíveis biomarcadores de resistência à insulina e diabetes tipo 2. Por último, como potenciais
biomarcadores de inflamação identificámos ceramidas de 18 carbonos, N-araquidonoil histidina,
fosfatidiletanolamina oxidada e lisofosfatidilcolina e fosfatidilserina não oxidadas.
Os resultados obtidos confirmaram a aplicabilidade clínica do nosso método ao nível da obesidade, uma
vez que foram identificadas várias alterações metabólicas, que de acordo com a literatura têm um
significado patológico. Mais ainda, foram identificados vários metabolitos como potenciais candidatos
a biomarcadores para a monitorização de doentes obesos e avaliação do seu risco de desenvolver doença
cardiovascular, resistência à insulina e diabetes tipo 2.
Esta tese de mestrado, representa assim, um primeiro passo na direção da aplicação da análise do
metaboloma de resíduos de impressões digitais em ambiente clínico, com potenciais aplicações que vão
para além da obesidade e doenças cardiometabólicas associadas.
The metabolome, is highly dynamic and is shaped by internal and external factors, reflecting the phenotype and providing a detailed snapshot of the body’s current state. Thus, metabolomics holds immense potential for clinical application, as demonstrated by the numerous candidate disease-related metabolite biomarkers. As firm believers that metabolomics can revolutionize medicine, we propose a non-invasive, untargeted metabolomics method using fingermarks, analyzed through extreme-resolution Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry (FT-ICR MS), to assess the human metabolome. Fingermarks are a biological sample rich in endogenous metabolites, providing a window into our metabolome. Additionally, each individual’s fingermark has a unique chemical profile influenced by genetics, diet, lifestyle, and health status, which can be leveraged for personalized health monitoring. The developed method is easy and time-efficient. Samples are processed by liquid-liquid extraction, diluted, and analyzed by FT-ICR MS, using direct infusion electrospray ionization (ESI) in positive and negative ion modes, eliminating the need for liquid chromatography. Developing standardized methods for fingermark collection, storage, and analysis is critical to ensuring reproducibility and comparability across studies. Our workflow was adapted from a previous method developed by our laboratory for forensics purposes. From it, pre-sampling, sampling, sample processing, and mass spectrometry conditions were optimized. To put our concept to the test, fingermarks from obese and non-obese were analyzed. Obesity-specific metabolic alterations were identified, with 43 metabolites being discriminant between both groups, with 41 being identified as lipids. Among these, 18-C ceramides, diacylglycerols (DAG), and glycerophospholipids were identified as potential biomarkers for patient monitoring. Altogether, these results hold great potential for the future application of this method in the clinical setting. This thesis thus represents a first step towards the use of untargeted metabolomics to analyze fingermarks from obese and non-obese individuals, as a promising non-invasive approach to characterize obesity and associated cardiovascular risk.
The metabolome, is highly dynamic and is shaped by internal and external factors, reflecting the phenotype and providing a detailed snapshot of the body’s current state. Thus, metabolomics holds immense potential for clinical application, as demonstrated by the numerous candidate disease-related metabolite biomarkers. As firm believers that metabolomics can revolutionize medicine, we propose a non-invasive, untargeted metabolomics method using fingermarks, analyzed through extreme-resolution Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry (FT-ICR MS), to assess the human metabolome. Fingermarks are a biological sample rich in endogenous metabolites, providing a window into our metabolome. Additionally, each individual’s fingermark has a unique chemical profile influenced by genetics, diet, lifestyle, and health status, which can be leveraged for personalized health monitoring. The developed method is easy and time-efficient. Samples are processed by liquid-liquid extraction, diluted, and analyzed by FT-ICR MS, using direct infusion electrospray ionization (ESI) in positive and negative ion modes, eliminating the need for liquid chromatography. Developing standardized methods for fingermark collection, storage, and analysis is critical to ensuring reproducibility and comparability across studies. Our workflow was adapted from a previous method developed by our laboratory for forensics purposes. From it, pre-sampling, sampling, sample processing, and mass spectrometry conditions were optimized. To put our concept to the test, fingermarks from obese and non-obese were analyzed. Obesity-specific metabolic alterations were identified, with 43 metabolites being discriminant between both groups, with 41 being identified as lipids. Among these, 18-C ceramides, diacylglycerols (DAG), and glycerophospholipids were identified as potential biomarkers for patient monitoring. Altogether, these results hold great potential for the future application of this method in the clinical setting. This thesis thus represents a first step towards the use of untargeted metabolomics to analyze fingermarks from obese and non-obese individuals, as a promising non-invasive approach to characterize obesity and associated cardiovascular risk.
Descrição
Tese de Mestrado, Bioquímica e Biomedicina, 2025, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências
Palavras-chave
Metabolómica clínica Impressões digitais FT-ICR MS Obesidade Doenças cardiometabólicas Teses de mestrado - 2025