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Publicação
Can chemotherapy response be predicted by studying inflammatory cells in the tumour microenvironment of pancreatic cancer?
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Resumo(s)
O cancro do pâncreas é considerado um dos tumores mais agressivos mundialmente, sendo o adenocarcinoma pancreático (PDAC) o tipo de tumor mais comum, com uma taxa de sobrevivência de seis meses após o diagnóstico. O diagnóstico do cancro do pâncreas continua a ser extremamente desafiante, o que aumenta a percentagem de pacientes com esta doença, os quais são apenas diagnosticados numa fase avançada. Uma vez que a taxa de incidência deste cancro está a aumentar cada vez mais, é crucial descobrir novas estratégias que permitam o diagnóstico numa fase mais inicial e tratar eficazmente esta doença fatal. O método mais eficaz para tratar esta doença é pela remoção do tumor cirurgicamente. No entanto, os pacientes que se encontram num estado muito avançado e deste modo não são considerados como aptos para a operação cirúrgica, são submetidos a tratamentos de quimioterapia (CTx), os quais não são bem-sucedido na maioria das vezes. Apesar do aumento de estudos realizados com o intuito de determinar marcadores preditivos capazes de determinar a resposta da CTx em pacientes com PDAC, esta predição continua a ser inatingível, apresentando, no entanto, resultados promissores. Assim sendo, ainda não é possível determinar dentro dos pacientes que precisem de CTx, quais irão ter uma boa resposta ou não ao tratamento. Os dois regimes de CTx mais comuns que são administrados a doentes com PDAC são gemcitabine com nab-paclitaxel (GEM/NAB) ou FOLFIRINOX, sendo que o FOLFIRINOX tem provado ser mais eficaz, no entanto, ainda não é possível saber qual dos dois tratamentos é melhor para certos tipos de pacientes com este cancro, assim como a melhor dosagem e o tempo de tratamento.
O microambiente tumoral (TME) tem dado que falar desde que foram encontradas características comuns que estão presentes em diferentes tipos de tumores, chamados os “hallmarks”. Com isto, chegou-se à conclusão de que as células neoplásticas não seriam as únicas relevantes de estudar, mas sim todas as outras células presentes no TME, as quais são responsáveis por facilitar ou inibir a progressão do tumor.
A imunofluorescência multiplex (mPlex) utiliza anticorpos que detetam e caracterizam diferentes marcadores simultaneamente no mesmo tecido, neste caso fixado em formalina e embebidos em parafina (FFPE).
Deste modo, este projeto pretende estudar se é possível determinar a resposta da CTx em doentes com PDAC através da quantificação, análise da distribuição espacial, e funções de células inflamatórias presentes no TME do cancro do pâncreas. Um objetivo secundário tem por base determinar qual dos regimes de CTx (FOLFIRINOX ou GEM/NAB) pode estar relacionado com a quantidade e características das células inflamatórias em doentes com PDAC.
Usaram-se tecidos FFPE de biópsias e peças cirúrgicas de 34 doentes (alguns com biópsia de pré-tratamento e peça cirúrgica pós-tratamento, para poder comparar como a CTx consegue modular os infiltrados inflamatórios). Tendo em consideração que dentro destes 34 doentes, apenas cinco após o tratamento já não apresentavam tumor, tendo demonstrado uma boa reposta local à CTx. As biópsias foram obtidas em doentes que inicialmente não se encontravam aptos para cirurgia e foram tratados com CTx de dois modos, por neoadjuvância (NAT), em que a CTx é administrada prévia à cirurgia, como também como sendo administrada como único tratamento.
Para caracterizar o TME, foi utilizada microscopia multiespectral, analisando dois painéis de imunofluorescência mPlex que continham cinco anticorpos em cada painel. A primeira mPlex incluía CD4 para células T auxiliares, CD8 para células T citotóxicas, FOXP3 para células T reguladoras e CD68 para macrófagos. Enquanto a segunda mPlex tinha CD3 para células T, CD56 para células natural killer (NK), CD80 para macrófagos anti tumorais e CD206 para macrófagos pró-tumorais. Em ambas mPlex a Citoqueratina 18 foi usada para identificar células epiteliais do PDAC. Foram realizados protocolos de imunofluorescência para cada marcador individualmente de modo a construir as suas livrarias espectrais, relativas aos picos de intensidade de fluorescência associados ao comprimento de onda do fluoróforo utilizado, tanto para os anticorpos conjugados como dos anticorpos secundários adicionados acoplados a um fluoróforo. Estas livrarias foram utilizadas para obter a imagem final combinando os cinco marcadores com as suas respetivas livrarias. De modo a obter as imagens, foi utlizado um microscópio de fluorescência equipado no topo por uma câmara multiespectral, o qual é controlado por um software chamado de Metamorph. Para a quantificação das células identificadas pelos respetivos marcadores, foi utlizado o software Fiji. O processo de quantificação das células foi distinto entre os dois tipos de tecidos (biópsias e peças cirúrgicas), tendo sido capturadas cinco áreas dentro de cada compartimento do TME (intrapitelial, estroma intratumoral e estroma da periferia) para as peças cirúrgicas e um número de áreas variável para as biópsias, nos compartimentos intraepitelial e estroma intratumoral, uma vez que se tentou capturar a biópsia por inteiro.
A análises estatísticas e os gráficos foram realizados usando o software GraphPad. Foram realizadas análises para correlacionar a expressão de cada marcador nos diferentes compartimentos tumorais, nos quais se observou diferenças significativas e se entendeu que todos os marcadores são mais expressos no estroma intratumoral. Foi feita uma comparação entre os dois tipos de tecidos e compartimentos simultaneamente, a qual também apresentou diferenças consideráveis, tendo sido observado que a maioria das células inflamatórias aumentaram de número após o tratamento de CTx, à exceção dos macrófagos pró-tumourais, das NK e das células NK-T. Curvas de sobrevivência Kaplan-Meier foram realizadas para avaliar o prognóstico, onde também se observaram diferenças e se chegou à conclusão que um maior número de células T pode estar associado a uma melhor taxa de sobrevivência. No entanto, um elevado número de células Treg e macrófagos pro-tumorais, pode estar associado a uma pior taxa de sobrevivência e menor tempo sem ocorrer progressão da doença. Outras análises foram realizadas para tentar correlacionar o tratamento de CTx administrado aos doentes assim como o estadio da sua doença, com a expressão de cada marcador, no entanto estas análises não demonstraram diferenças relevantes. Uma correlação também foi feita entre a expressão de cada marcador entre os doentes que tiveram uma resposta completa local à CTx e os que não obtiveram resposta. Nesta análise, concluiu-se que um baixo número de Treg e macrófagos pro-tumorais, assim como alto número de macrófagos anti-tumorais, pode estar associado com a resposta à CTx, uma vez que os doentes que responderam bem ao tratamento apresentavam poucas células Treg e macrófagos pro-tumorais e elevado número de macrófagos anti-tumorais. Para estas análises, foram realizados testes estatísticos, tendo começado por testes de normalidade, de modo a decidir quais as melhores análises para cada categoria. Para as que seguiam a normalidade, foram feitos testes de student-t ou ANOVA dependendo do número de amostras a comparar. No caso de não seguirem a normalidade, em vez desses, foram realizados testes de Kruskal-Wallis ou Mann-Whitney.
Em conclusão, com este estudo ainda não é possível predizer a resposta à CTx tendo por base o estudo das células inflamatórias, mas a presença de algumas destas células pode estar relacionada com melhor resposta ao tratamento. Futuramente, esta abordagem pode ter um valor relevante em ajudar os médicos a determinar quais os doentes que devem responder à CTx a partir do momento em que o diagnóstico for realizado.
Posteriormente, algo que poderia ser feito de modo a continuar este estudo seria o aumento do número de doentes e também de biomarcadores para analisar tanto células inflamatórias como de outros tipos de células que se encontrem no TME deste cancro, incluindo também outros marcadores que poderiam ser importantes de avaliar, como os de exaustão para entender se algumas destas células inflamatórias podem estar a ser suprimidas, por exemplo. Para isto, algumas novas tecnologias têm sido abordadas que permitem a análise de até 100 biomarcadores num único tecido e poderiam ser uma boa estratégia a seguir.
Pancreatic cancer is one of the most aggressive cancers worldwide, being pancreatic adenocarcinoma (PDAC) the most common type. The most effective method to treat this disease is surgical removal of the tumour. However, patients with advanced stages (locally advanced or with metastatic disease) who are not suitable for surgery are treated with chemotherapy (CTx), which is unsuccessful in most cases. Although many studies have been conducted to find predictive markers to determine the CTx response in PDAC patients, this still remains unreachable. This project aims to study whether it is possible to predict response to CTx in PDAC patients through the quantification, analyses of spatial distribution, and functional status of inflammatory cells in the tumour microenvironment (TME) of this cancer. Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) blocks of 34 PDAC patient biopsies and surgical specimens (some with paired pre-treatment biopsy and surgical specimen post-CTx to compare how CTx modifies the immune infiltrates) were used. To characterise the TME, multispectral microscopy was used, analysing two multiplex immunofluorescence panels with CD3 (T cells), CD4 (helper T cells), CD8 (cytotoxic T cells), FOXP3 (regulatory T cells), CD56 (natural killer cells), CD68 (macrophages), CD80 (anti-tumoural macrophages), CD206 (pro-tumoural macrophages), and Cytokeratin 18 (epithelial cells). Significant differences were observed in the number of the cells throughout the different compartments (intraepithelial, intratumoural stroma and periphery stroma), being all mostly expressed in the intratumoural. Comparison between both tissues and compartments also demonstrated meaningful differences. Kaplan-Meier curves were made to evaluate the prognosis, where differences were also observed. Other analyses attempted to correlate the treatment and staging of disease of each patient with their marker expression, however, no significant differences were observed. In addition, a correlation between the number of the cells in patients who had a local complete response after CTx and those that did not was also made. With the results obtained in this study, we are still not able to predict response to CTx, but we have found that the presence of specific inflammatory cells may be associated to a better response.
Pancreatic cancer is one of the most aggressive cancers worldwide, being pancreatic adenocarcinoma (PDAC) the most common type. The most effective method to treat this disease is surgical removal of the tumour. However, patients with advanced stages (locally advanced or with metastatic disease) who are not suitable for surgery are treated with chemotherapy (CTx), which is unsuccessful in most cases. Although many studies have been conducted to find predictive markers to determine the CTx response in PDAC patients, this still remains unreachable. This project aims to study whether it is possible to predict response to CTx in PDAC patients through the quantification, analyses of spatial distribution, and functional status of inflammatory cells in the tumour microenvironment (TME) of this cancer. Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) blocks of 34 PDAC patient biopsies and surgical specimens (some with paired pre-treatment biopsy and surgical specimen post-CTx to compare how CTx modifies the immune infiltrates) were used. To characterise the TME, multispectral microscopy was used, analysing two multiplex immunofluorescence panels with CD3 (T cells), CD4 (helper T cells), CD8 (cytotoxic T cells), FOXP3 (regulatory T cells), CD56 (natural killer cells), CD68 (macrophages), CD80 (anti-tumoural macrophages), CD206 (pro-tumoural macrophages), and Cytokeratin 18 (epithelial cells). Significant differences were observed in the number of the cells throughout the different compartments (intraepithelial, intratumoural stroma and periphery stroma), being all mostly expressed in the intratumoural. Comparison between both tissues and compartments also demonstrated meaningful differences. Kaplan-Meier curves were made to evaluate the prognosis, where differences were also observed. Other analyses attempted to correlate the treatment and staging of disease of each patient with their marker expression, however, no significant differences were observed. In addition, a correlation between the number of the cells in patients who had a local complete response after CTx and those that did not was also made. With the results obtained in this study, we are still not able to predict response to CTx, but we have found that the presence of specific inflammatory cells may be associated to a better response.
Descrição
Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2023, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.
Palavras-chave
Pancreatic cancer Tumour microenvironment Inflammatory cells Chemotherapy Multiplex immunofluorescence Teses de mestrado - 2023