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Publicação
Transcriptional regulatory mechanisms involved in CYP46A1 up-regulation by histone deacetylase inhibitors:from chromatin structure to transcription factors
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Resumo(s)
Apart from being an essential component of cellular membranes and having a role as a signaling molecule, cholesterol is also the precursor of several bioactive molecules that include bile acids, steroid hormones, oxysterols and vitamin D. In the brain constant levels of this sterol are required for normal functioning and the homeostasis is maintained, in part, by an efficient blood-brain barrier that prevents exchanges with lipoprotein cholesterol from circulation. For that reason, de novo and in situ synthesis occur to meet cholesterol needs in the central nervous system (CNS), which despite the low synthesis rate must be excreted at some degree in order to keep its steady state. The conversion of cholesterol into 24(S)-hydroxycholesterol, by the neuronalspecific cytochrome P450 cholesterol 24-hydroxylase (CYP46A1) has been described as the major elimination mechanism. The main goal of this work was to characterize the effect of histone deacetylase (HDAC) inhibition in the transcriptional regulation of CYP46A1 gene and the molecular mechanism underlying such effect. We started by demonstrating that the inhibition of HDAC activity by trichostatin A (TSA), valproic acid and sodium butyrate cause a potent induction of both CYP46A1 promoter activity and endogenous expression. Indeed, we have shown for the first time that TSA induces an overall increase in histone acetylation levels at CYP46A1 proximal promoter, as a result of the detachment of HDACs and recruitment of histone acetyltransferases (HAT), in a process dependent on Sp3 transcription factor decreased binding to particular cis-elements. This change in chromatin structure culminates in the recruitment of RNA polymerase II and CYP46A1 gene activation. Nevertheless, the fact that histone deacetylation was evident at a time point when the HDAC/HAT ratio should still favor acetylation, led us to investigate if mechanisms besides histone hyperacetylation could participate in the TSA mediated derepression of CYP46A1 gene. Interestingly, we identified the participation of the mitogen-activated kinase kinase (MEK)-extracellular signal-regulated kinase (ERK) signaling pathway in the CYP46A1 response to TSA. A decrease in ERK1/2 phosphorylation levels was observed after TSA treatment concomitantly with a decrease in Sp3 binding activity. Inhibition of protein phosphatase activity by pre-treatment with okadaic acid (OA) completely reversed these changes, and impaired the TSA-mediated CYP46A1 activation without affecting promoter histone hyperacetylation. Our results also show that TSA treatment induces the dissociation of phosphorylated ERK1/2 from the CYP46A1 promoter and specifically from the Sp3-containing DNA fragments. This suggests that in the context of the CYP46A1 promoter phosphorylated Sp3 acts as a transcriptional repressor being responsible for the recruitment of co-repressor complexes, with and without HDAC activity. Moreover, our work highlights the importance of the MEK-ERK signaling pathway in the control of brain cholesterol elimination. The importance of CYP46A1 in cholesterol homeostasis and the drastic effect of HDAC inhibitors (HDACi) in its expression, lead us to evaluate if these compounds can affect the expression of other key players in neuronal cholesterol metabolism. In the last part of our work we have identified TSA as a cholesterol-lowering molecule, by modulating the transcription of other genes involved in cholesterol metabolism in human neuroblastoma cells, namely by up-regulating genes that control cholesterol efflux and dow-regulating genes involved in cholesterol synthesis and uptake, thus leading to an overall decrease in total cholesterol content. Moreover, we have shown that TSA is also able to partially reverse the increased cholesterol content and the transcriptional changes, induced by pathological lysosomal accumulation of intracellular cholesterol. Overall, these results clarify the role of HDACi in the modulation of CYP46A1 gene transcription as well as other key genes in cholesterol metabolism, comprising a significant contribution in the elucidation of the molecular mechanism involved in the transcriptional regulation of CYP46A1 gene and emphasizing the idea of HDAC inhibition as a promising therapeutic tool in neurodegenerative disorders with impaired cholesterol metabolismo.
O colesterol é uma molécula essencial à vida. Para além de desempenhar um papel crucial na estrutura das membranas celulares, através da regulação da permeabilidade e fluidez das mesmas, o colesterol é também percursor de inúmeras moléculas de extrema relevância biológica tais como os ácidos biliares, os oxisteróis, as hormonas esteroides e a vitamina D, podendo também atuar como uma molécula sinalizadora. No encéfalo, o colesterol está maioritariamente na forma não esterificada e encontra-se associado às bainhas de mielina e às membranas plasmáticas dos neurónios e células da glia. O colesterol é também essencial à formação e propagação de sinapses, ao crescimento dendrítico e à estabilidade dos microtúbulos. Além disso, o sistema nervoso central (SNC) necessita de níveis constantes de colesterol para um correto funcionamento, sendo que a homeostasia é assegurada, em parte, pela barreira hematoencefálica que impede trocas com o colesterol em circulação. Por esta razão, todo o colesterol presente no encéfalo deriva de uma síntese de novo e in situ. Apesar de no SNC do adulto a síntese de colesterol ser reduzida, uma fração necessita de ser excretada, de forma a manter os níveis de colesterol constantes. A conversão do colesterol em 24(S)- hidroxicolesterol, pelo enzima 24(S)-hidroxilase (CYP46A1), foi descrita como o principal mecanismo de eliminação. O produto enzimático (oxisterol), contrariamente ao colesterol, atravessa com facilidade a barreira hemato-encefálica, entra em circulação e é posteriormente eliminado no fígado, completando desta forma o processo de transporte reverso do colesterol. Nos últimos anos, um grande número de estudos aponta para uma relação entre alterações no metabolismo do colesterol e o desenvolvimento de doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer, a doença de Huntington ou a doença de Niemann-Pick tipo C. Para além disso, inúmeras evidências sugerem que a indução do CYP46A1 poderá ter consequências benéficas, nomeadamente na doença de Alzheimer. De facto a sobre-expressão do CYP46A1 poderá ter um efeito inibitório direto sobre a produção do péptido β-amilóide, um efeito indireto relacionado com a diminuição dos níveis de colesterol das membranas neuronais, ou por aumentar a ativação dos genes alvo do receptor nuclear liver X receptor. O principal objectivo deste trabalho foi a caracterização do efeito da inibição das desacetilases de histonas (HDAC) na regulação da transcrição do gene CYP46A1, bem como dos mecanismos moleculares subjacentes a esse mesmo efeito. Na primeira parte deste trabalho, começámos por demonstrar que a inibição da atividade das HDACs através do tratamento com os inibidores tricostatina A (TSA), ácido valpróico e butirato de sódio, causam uma drástica indução da atividade do promotor e da expressão endógena do gene CYP46A1. Observámos também, pela primeira vez, que o tratamento com TSA induz um aumento significativo dos níveis de acetilação das histonas do promotor próximo do gene CYP46A1, sendo que este efeito resulta da diminuição da presença de HDACs e do recrutamento de acetiltransferases de histonas (HAT). Estudos anteriores do nosso grupo identificaram como essenciais na expressão basal do gene CYP46A1 factores de transcrição da família Sp e, neste estudo, demonstrámos que as proteínas Sp1 e Sp4 são também cruciais para a ativação do CYP46A1 pelo TSA. No entanto o efeito do TSA parece depender da diminuição da ligação do factor de transcrição Sp3 a elementos de resposta específicos do promotor, uma vez que uma diminuição de ligação desta proteína está relacionada com a diminuição de HDACs presentes no promotor. De uma forma geral, as modificações na estrutura da cromatina e no complexo proteico na região do promotor próximo induzidas pelo TSA culminam no recrutamento da RNA polimerase II e na consequente ativação do gene CYP46A1. A evidência de que o nível de acetilação das histonas a determinado momento não reflete a razão entre os níveis dos enzimas HDAC/HAT presentes no promotor, conduziu-nos à investigação de mecanismos independentes da hiperacetilação de histonas que pudessem contribuir para a ativação do gene CYP46A1 pelo TSA. De facto, na segunda parte do nosso trabalho identificámos a participação da via de sinalização da cinase de proteínas ativada por mitogénios (MAPK) na resposta do CYP46A1 ao TSA. Através do pré-tratamento com inibidores químicos específicos bem como a utilização de dominantes negativos da cinase terminal desta via, a cinase de proteínas regulada por sinais extracelulares (ERK), concluímos que a inibição da atividade deste enzima potencia o efeito do TSA, contrariamente ao efeito da inibição das fosfatases de proteína, através do pré-tratamento com ácido ocadáico, que bloqueia quase na totalidade a ativação do gene CYP46A1 pelo TSA. A análise dos níveis de fosforilação da ERK1/2 demonstrou que o TSA induz uma diminuição do nível de ativação destas cinases, bem como da atividade de ligação da proteína Sp3 ao DNA, efeitos esses que são revertidos pelo pré-tratamento com ácido ocadáico, sem que o nível de hiperacetilação das histonas do promotor seja afetado. Os nossos resultados demonstram ainda que o tratamento com TSA induz a dissociação da forma fosforilada da ERK1/2 do promotor do CYP46A1, especificamente, dos fragmentos de DNA que contêm o factor de transcrição Sp3, sugerindo que no contexto do promotor do CYP46A1 a proteína Sp3 atua como um repressor da transcrição e é responsável pelo recrutamento de complexos co-repressores, com e/ou sem atividade HDAC. O TSA ao modular a ativação da ERK1/2 regula indiretamente a atividade deste factor de transcrição e consequentemente a expressão do CYP46A1. De facto, a replicação do efeito do ácido ocadáico e da inibição da atividade da ERK1/2 na atividade do promotor e expressão basal do gene CYP46A1 evidencia também a importância desta via de sinalização intracelular no controlo da eliminação de colesterol do encéfalo. A importância do CYP46A1 na homeostasia do colesterol bem como o efeito drástico dos inibidores das HDACs na sua expressão, conduziu à avaliação do efeito destes compostos na expressão de genes chave no metabolismo do colesterol em células neuronais. Como tal, na última parte deste trabalho demonstrámos a capacidade do TSA de diminuir os níveis de colesterol em células de neuroblastoma humano, através da regulação da expressão de genes envolvidos no metabolismo do colesterol, nomeadamente, através da indução de genes envolvidos no controlo do efluxo (transportadores ATP-binding cassette) e catabolismo (CYP46A1), e repressão de genes essenciais para a síntese (3-metilglutaril Coenzima A redutase) e captação de colesterol (receptor de lipoproteínas de baixa densidade), culminado desta forma na diminuição do conteúdo total de colesterol. O tratamento com o composto U18666A, que mimetiza o fenótipo da doença de Niemann-Pick tipo C, caracterizado pela acumulação patológica de colesterol nos lisossomas, resultou no aumento dos níveis de colesterol em células de neuroblastoma humano, bem com no aumento da expressão de genes envolvidos na síntese e captação de colesterol e diminuição dos genes responsáveis pelo efluxo. No entanto, o tratamento com TSA reverteu todos esses efeitos, contribuindo para a correção das perturbações no metabolismo do colesterol. Apesar de já ter sido demonstrado o efeito benéfico da inibição das HDACs em fibroblastos de pacientes com a doença de Niemann-Pick tipo C, este trabalho demonstra pela primeira vez a capacidade destes compostos de reverter, ao nível da transcrição, os efeitos da acumulação de colesterol nos lisossomas. Em conclusão, os resultados apresentados nesta tese identificam os inibidores das HDACs como agentes farmacológicos que poderão eventualmente vir a ser usados na indução da transcrição do gene CYP46A1, bem como na modelação da transcrição de genes que participam de forma relevante no metabolismo do colesterol no encéfalo. Para além disso constitui uma contribuição significativa para a compreensão dos mecanismos moleculares responsáveis pela regulação da transcrição do gene CYP46A1, identificando a via das MAPKs como umas das vias de sinalização responsáveis pelo controlo do catabolismo do colesterol no encéfalo. A compreensão dos mecanismos moleculares controlados pelos inibidores das HDACs, e envolvidos na homeostasia do colesterol no encéfalo, poderá de facto constituir uma plataforma para o desenvolvimento de possíveis intervenções farmacológicas que vão da neurodegenerescência ao cancro.
O colesterol é uma molécula essencial à vida. Para além de desempenhar um papel crucial na estrutura das membranas celulares, através da regulação da permeabilidade e fluidez das mesmas, o colesterol é também percursor de inúmeras moléculas de extrema relevância biológica tais como os ácidos biliares, os oxisteróis, as hormonas esteroides e a vitamina D, podendo também atuar como uma molécula sinalizadora. No encéfalo, o colesterol está maioritariamente na forma não esterificada e encontra-se associado às bainhas de mielina e às membranas plasmáticas dos neurónios e células da glia. O colesterol é também essencial à formação e propagação de sinapses, ao crescimento dendrítico e à estabilidade dos microtúbulos. Além disso, o sistema nervoso central (SNC) necessita de níveis constantes de colesterol para um correto funcionamento, sendo que a homeostasia é assegurada, em parte, pela barreira hematoencefálica que impede trocas com o colesterol em circulação. Por esta razão, todo o colesterol presente no encéfalo deriva de uma síntese de novo e in situ. Apesar de no SNC do adulto a síntese de colesterol ser reduzida, uma fração necessita de ser excretada, de forma a manter os níveis de colesterol constantes. A conversão do colesterol em 24(S)- hidroxicolesterol, pelo enzima 24(S)-hidroxilase (CYP46A1), foi descrita como o principal mecanismo de eliminação. O produto enzimático (oxisterol), contrariamente ao colesterol, atravessa com facilidade a barreira hemato-encefálica, entra em circulação e é posteriormente eliminado no fígado, completando desta forma o processo de transporte reverso do colesterol. Nos últimos anos, um grande número de estudos aponta para uma relação entre alterações no metabolismo do colesterol e o desenvolvimento de doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer, a doença de Huntington ou a doença de Niemann-Pick tipo C. Para além disso, inúmeras evidências sugerem que a indução do CYP46A1 poderá ter consequências benéficas, nomeadamente na doença de Alzheimer. De facto a sobre-expressão do CYP46A1 poderá ter um efeito inibitório direto sobre a produção do péptido β-amilóide, um efeito indireto relacionado com a diminuição dos níveis de colesterol das membranas neuronais, ou por aumentar a ativação dos genes alvo do receptor nuclear liver X receptor. O principal objectivo deste trabalho foi a caracterização do efeito da inibição das desacetilases de histonas (HDAC) na regulação da transcrição do gene CYP46A1, bem como dos mecanismos moleculares subjacentes a esse mesmo efeito. Na primeira parte deste trabalho, começámos por demonstrar que a inibição da atividade das HDACs através do tratamento com os inibidores tricostatina A (TSA), ácido valpróico e butirato de sódio, causam uma drástica indução da atividade do promotor e da expressão endógena do gene CYP46A1. Observámos também, pela primeira vez, que o tratamento com TSA induz um aumento significativo dos níveis de acetilação das histonas do promotor próximo do gene CYP46A1, sendo que este efeito resulta da diminuição da presença de HDACs e do recrutamento de acetiltransferases de histonas (HAT). Estudos anteriores do nosso grupo identificaram como essenciais na expressão basal do gene CYP46A1 factores de transcrição da família Sp e, neste estudo, demonstrámos que as proteínas Sp1 e Sp4 são também cruciais para a ativação do CYP46A1 pelo TSA. No entanto o efeito do TSA parece depender da diminuição da ligação do factor de transcrição Sp3 a elementos de resposta específicos do promotor, uma vez que uma diminuição de ligação desta proteína está relacionada com a diminuição de HDACs presentes no promotor. De uma forma geral, as modificações na estrutura da cromatina e no complexo proteico na região do promotor próximo induzidas pelo TSA culminam no recrutamento da RNA polimerase II e na consequente ativação do gene CYP46A1. A evidência de que o nível de acetilação das histonas a determinado momento não reflete a razão entre os níveis dos enzimas HDAC/HAT presentes no promotor, conduziu-nos à investigação de mecanismos independentes da hiperacetilação de histonas que pudessem contribuir para a ativação do gene CYP46A1 pelo TSA. De facto, na segunda parte do nosso trabalho identificámos a participação da via de sinalização da cinase de proteínas ativada por mitogénios (MAPK) na resposta do CYP46A1 ao TSA. Através do pré-tratamento com inibidores químicos específicos bem como a utilização de dominantes negativos da cinase terminal desta via, a cinase de proteínas regulada por sinais extracelulares (ERK), concluímos que a inibição da atividade deste enzima potencia o efeito do TSA, contrariamente ao efeito da inibição das fosfatases de proteína, através do pré-tratamento com ácido ocadáico, que bloqueia quase na totalidade a ativação do gene CYP46A1 pelo TSA. A análise dos níveis de fosforilação da ERK1/2 demonstrou que o TSA induz uma diminuição do nível de ativação destas cinases, bem como da atividade de ligação da proteína Sp3 ao DNA, efeitos esses que são revertidos pelo pré-tratamento com ácido ocadáico, sem que o nível de hiperacetilação das histonas do promotor seja afetado. Os nossos resultados demonstram ainda que o tratamento com TSA induz a dissociação da forma fosforilada da ERK1/2 do promotor do CYP46A1, especificamente, dos fragmentos de DNA que contêm o factor de transcrição Sp3, sugerindo que no contexto do promotor do CYP46A1 a proteína Sp3 atua como um repressor da transcrição e é responsável pelo recrutamento de complexos co-repressores, com e/ou sem atividade HDAC. O TSA ao modular a ativação da ERK1/2 regula indiretamente a atividade deste factor de transcrição e consequentemente a expressão do CYP46A1. De facto, a replicação do efeito do ácido ocadáico e da inibição da atividade da ERK1/2 na atividade do promotor e expressão basal do gene CYP46A1 evidencia também a importância desta via de sinalização intracelular no controlo da eliminação de colesterol do encéfalo. A importância do CYP46A1 na homeostasia do colesterol bem como o efeito drástico dos inibidores das HDACs na sua expressão, conduziu à avaliação do efeito destes compostos na expressão de genes chave no metabolismo do colesterol em células neuronais. Como tal, na última parte deste trabalho demonstrámos a capacidade do TSA de diminuir os níveis de colesterol em células de neuroblastoma humano, através da regulação da expressão de genes envolvidos no metabolismo do colesterol, nomeadamente, através da indução de genes envolvidos no controlo do efluxo (transportadores ATP-binding cassette) e catabolismo (CYP46A1), e repressão de genes essenciais para a síntese (3-metilglutaril Coenzima A redutase) e captação de colesterol (receptor de lipoproteínas de baixa densidade), culminado desta forma na diminuição do conteúdo total de colesterol. O tratamento com o composto U18666A, que mimetiza o fenótipo da doença de Niemann-Pick tipo C, caracterizado pela acumulação patológica de colesterol nos lisossomas, resultou no aumento dos níveis de colesterol em células de neuroblastoma humano, bem com no aumento da expressão de genes envolvidos na síntese e captação de colesterol e diminuição dos genes responsáveis pelo efluxo. No entanto, o tratamento com TSA reverteu todos esses efeitos, contribuindo para a correção das perturbações no metabolismo do colesterol. Apesar de já ter sido demonstrado o efeito benéfico da inibição das HDACs em fibroblastos de pacientes com a doença de Niemann-Pick tipo C, este trabalho demonstra pela primeira vez a capacidade destes compostos de reverter, ao nível da transcrição, os efeitos da acumulação de colesterol nos lisossomas. Em conclusão, os resultados apresentados nesta tese identificam os inibidores das HDACs como agentes farmacológicos que poderão eventualmente vir a ser usados na indução da transcrição do gene CYP46A1, bem como na modelação da transcrição de genes que participam de forma relevante no metabolismo do colesterol no encéfalo. Para além disso constitui uma contribuição significativa para a compreensão dos mecanismos moleculares responsáveis pela regulação da transcrição do gene CYP46A1, identificando a via das MAPKs como umas das vias de sinalização responsáveis pelo controlo do catabolismo do colesterol no encéfalo. A compreensão dos mecanismos moleculares controlados pelos inibidores das HDACs, e envolvidos na homeostasia do colesterol no encéfalo, poderá de facto constituir uma plataforma para o desenvolvimento de possíveis intervenções farmacológicas que vão da neurodegenerescência ao cancro.
Descrição
Tese de doutoramento, Farmácia (Biologia Celular e Molecular), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2012
Palavras-chave
Teses de doutoramento - 2012