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Small molecule PGC-1a activators: a novel class of anti-neurodegenerative therapeutics
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Autores
Resumo(s)
Parkinson’s disease (PD) is an age-related neurodegenerative disorder, affecting primarily, the
central nervous system. The major hallmark of PD is the death of dopaminergic neurons in the
substantia nigra pars compacta, with consequently decreased levels of dopamine in the
striatum. During aging many cellular processes suffer alterations, such as increased
mitochondrial damage, ROS accumulation and decreased proteostatic mechanisms. Altogether,
these events can ultimately lead to degeneration of neuronal cells and the development of
neurodegenerative diseases.
Peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ) coactivator1α (PGC-1α) is the most
studied member of the PGC-1 family and can be induced, in a tissue-specific manner, by
physiological cues, such as exercise, fasting and cold exposure. PGC-1α1 is directly linked to
mitochondrial biogenesis and cell detoxification of reactive oxygen species. Several studies
have shown that PGC-1α1 expression tends to decrease with aging. Conversely, its activation
prevents dopaminergic neuron loss, in both genetic and toxin-induced cellular models of PD.
PGC-1α1 does not have predictable DNA- or ligand-binding domains, which poses a challenge
to a direct pharmacological intervention. Thus, being able to target this coactivator through its
stabilization is of utmost importance, in order to help find new approaches against
neurodegeneration.
The aim of this study is to validate in a neuronal cellular system, eleven small-molecules that
were previously identified as PGC-1α1 stabilizers in brown adipocytes, where this coactivator
was first identified. The validation process comprehended: selection of the cellular model for
compound screening; screening of the small PGC-1α1 activators on the chosen cellular model,
through dose-dependent cell viability assays and evaluation of mRNA relative expression levels
of PGC-1α1 downstream target genes; and, finally the evaluation of the effects of each selected
compound in a cellular model of PD.
We were able to select five of the eleven small-molecules tested as effective modulators of
PGC-1α downstream targets, in a N2a mouse neuroblastoma cell line. Upon pre-conditioning
of cells with the compounds followed by treatment with 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP+),
some of the selected compounds increased both cellular ATP levels and cellular viability,
restoring control levels. Altogether, the results from the present study revealed that a small
group of the tested compounds demonstrated protective effects against MPP+-treated cells,
possibly by stabilizing PGC-1α1.
A doença de Parkinson (DP) é uma doença associada ao envelhecimento que afeta, principalmente o sistema nervoso central. A doença manifesta-se por diversos sintomas, nomeadamente distúrbios do sono, depressão, disfunção olfatória e gastrointestinal, assim como disfunção autonómica e cognitiva; e sintomas motores, característicos da doença, como tremores, instabilidade postural, desequilibro, bradicinesia e hipocinesia, cujo seu aparecimento/desenvolvimento ocorre já numa fase em que cerca de 80% da dopamina no estriado se encontra depletada e em que já ocorreu degenerescência de cerca de 60% a 70% dos neurónios dopaminérgicos, da substantia nigra pars compacta. Uma vez que os sintomas motores são característicos desta patologia, o diagnóstico da mesma torna-se possível, através da observação clínica de pelo menos quatro destes sinais motores. Uma das características principais desta doença é o surgimento de inclusões proteicas, constituídas maioritariamente por α-sinucleína, ubiquitina, neurofilamentos e chaperones moleculares. Estas inclusões são designadas por corpos de Lewy e pensa-se que a agregação que leva à sua formação está associada ao desenvolvimento de espécies intermediárias tóxicas para as células. Como mecanismo de proteção, os sistemas de defesa das células promovem a agregação destas espécies intermediárias, que são observáveis em amostras de tecido de cérebros de pacientes com a DP. Pensa-se que o aparecimento dos corpos de Lewy ocorre anos antes da morte dos neurónios dopaminérgicos, prevendo-se que o seu surgimento seja anterior ao desenvolvimento da fase sintomática da doença. O envelhecimento é caracterizado pela alteração de processos celulares, tais como aumento de danos mitocondriais, acumulação de espécies reativas de oxigénio e ainda pela regulação negativa dos mecanismos de homeostase proteica. Consequentemente, estes eventos podem levar à degenerescência das células neuronais e ao desenvolvimento de doenças neurodegenerativas. A família do co ativador 1 do recetor γ ativado por proliferadores de peroxissomas (PGC-1) é constituída por três membros fundadores: o PGC-1α, o PGC-1β e o co ativador relacionado com o PGC-1 (PRC). Tanto o PGC-1α como o PGC-1β podem apresentar funções complementares ou sobrepostas, essencialmente em tecidos oxidativos, como o cérebro, o coração, o tecido adiposo e o músculo esquelético. Por sua vez o PRC é expresso em todos os tecidos. O PGC-1α é um dos membros mais estudados da família do PGC-1, sendo induzido de uma forma especifica para cada tecido, em função de fatores como o exercício, o jejum e a exposiçãovii ao frio. Está ainda diretamente envolvido na biogénese mitocondrial e na destoxificação de espécies reativas de oxigénio. Este membro da família PGC-1 pode ser expresso sob a forma de diversas isoformas, que podem resultar na substituição do promotor do gene usado (proximal ou distante) e/ou de splicing alternativo, dependendo do estímulo ao qual a célula é sujeita. Cada isoforma pode apresentar funções distintas e ser específica de determinados tecidos. O PGC-1α1, inicialmente apenas conhecido como PGC-1α, foi a primeira isoforma a ser descoberta e corresponde ao transcrito canónico. Mais ainda, modificações pós-tradução, tais como a fosforilação, acetilação/deacetilação, SUMO-ilação e metilação, parecem estar envolvidas na modulação da atividade deste co ativador. Estudos revelaram uma redução da expressão do PGC-1α1 com o envelhecimento. Por outro lado, a sua ativação previne a perda de neurónios, em modelos celulares da DP. Outros estudos conseguiram ainda relacionar mutações genéticas, associadas ao desenvolvimento da DP, com a diminuição dos níveis de expressão do PGC-1α1. Mutações no gene da parquina, que levam à perda da sua função, podem promover a repressão da transcrição deste co ativador através da acumulação da PARIS, um substrato de interação com a parquina. Dado que não foram ainda identificados no PGC-1α1 domínios funcionais de ligação ao DNA nem a ligandos, a sua intervenção farmacológica torna-se um desafio. Assim, a estabilização deste co ativador poderá possibilitar o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas contra a neurodegenerescência. Através de um estudo realizado pelo Dr. Jorge Ruas e colaboradores, em que procederam à realização de um high-throughput screening, baseado em modelos celulares, foi identificado um grupo de compostos químicos com capacidade de ativar e estabilizar o PGC-1α1 em culturas de adipócitos do tecido adiposo castanho. A capacidade destes compostos para estabilizarem o PGC-1 foi avaliada através da medição dos níveis de expressão proteica deste co ativador, assim como dos níveis de expressão relativos do mRNA dos genes regulados pelo mesmo e ainda pela medição da respiração mitocondrial, no mesmo modelo celular. Desta forma, com base no estudo anterior, o objetivo do presente projeto assenta na validação, num sistema celular neuronal, de onze moléculas que foram previamente identificadas como estabilizadoras do PGC-1α1 e selecionadas para validação no sistema celular aqui descrito. O processo de validação foi decomposto em: seleção do modelo celular mais adequado; screening dos compostos, recorrendo a ensaios de viabilidade celular e à avaliação dos níveis de expressão relativos do mRNA de genes regulados pelo PGC-1α1; e à avaliação dos efeitos de cada composto selecionado, num modelo celular da DP. Nesta avaliação foram testados novamente os níveis de expressão relativos do mRNA de genes regulados pelo PGC-1α1 e outros fatoresviii como a influência destes compostos na viabilidade celular, nos níveis de produção de ATP e na produção de espécies reativas de oxigénio, no modelo celular da doença. A capacidade protetora destes compostos, face a um insulto com 1-metil-4-fenilpiridina (MPP+), nestas condições foi também avaliada. Dos onze compostos, cinco foram selecionados como moduladores efetivos de genes regulados pelo PGC-1α1, numa linha celular de neuroblastoma de ratinho (células N2a). Após pré- condicionamento das células com os compostos e tratamento com MPP+, alguns dos compostos selecionados promoveram o aumento dos níveis de ATP e de viabilidade celular, recuperando os níveis do controlo. Subsequentemente, alguns destes compostos mostraram ainda uma tendência para aumentar os níveis relativos de mRNA de genes como o da UCP1 (proteína desacopladora localizada nas mitocôndrias, que leva ao desacoplamento de eletrões da cadeia transportadora de eletrões e que, de entre as suas diversas funções se encontra envolvida na produção de calor, em adipócitos e na destoxificação de espécies reativas de oxigénio). O NRF- 1, associado à respiração mitocondrial e o Glut-4, membro dos transportadores de glucose, correspondem também a outras classes de genes que pareceram aumentar na presença de alguns dos compostos selecionados. Os resultados do presente estudo revelaram ainda que um pequeno grupo dos compostos testados parecem ter efeitos protetores em células tratadas com MPP+, possivelmente por promoverem a estabilização do PGC-1α1. No caso particular de um dos compostos testados, o PGC-1α1 parece ser ativado pela via do cAMP/p-CREB/CRE, uma das principais vias de ativação deste co ativador. Apesar de os outros compostos não terem demonstrado alterações nesta via, poderão estabilizar ou ativar o PGC-1α1 através de vias alternativas. Uma das hipóteses é que estes compostos possam promover modificações pós-tradução responsáveis por regular tanto a estabilidade como a função e localização deste co ativador. Dado que o mecanismo de ação destes compostos não é conhecido, é de extrema importância avaliar a sua capacidade de estabilizar o PGC-1α1 em diferentes sistemas celulares. Uma vez que a atividade biológica deste co ativador depende da presença de fatores de transcrição específicos, a sua estabilização pode não ser suficiente para a sua ativação nos diferentes sistemas celulares. Através dos diversos estudos que envolvem o PGC-1α tem-se vindo, cada vez mais a realçar o papel preponderante deste co ativador em diversos tecidos, com maior relevância para os tecidos oxidativos. Desta forma, encontrar compostos capazes de modular e estabilizar este co ativador, mantendo os seus níveis fisiológicos nestes tecidos é de extrema relevância, de formaix a possibilitar o desenvolvimento de estratégias terapêuticas comuns a patologias de diferentes origens, em que o PGC-1α poderá estar envolvido.
A doença de Parkinson (DP) é uma doença associada ao envelhecimento que afeta, principalmente o sistema nervoso central. A doença manifesta-se por diversos sintomas, nomeadamente distúrbios do sono, depressão, disfunção olfatória e gastrointestinal, assim como disfunção autonómica e cognitiva; e sintomas motores, característicos da doença, como tremores, instabilidade postural, desequilibro, bradicinesia e hipocinesia, cujo seu aparecimento/desenvolvimento ocorre já numa fase em que cerca de 80% da dopamina no estriado se encontra depletada e em que já ocorreu degenerescência de cerca de 60% a 70% dos neurónios dopaminérgicos, da substantia nigra pars compacta. Uma vez que os sintomas motores são característicos desta patologia, o diagnóstico da mesma torna-se possível, através da observação clínica de pelo menos quatro destes sinais motores. Uma das características principais desta doença é o surgimento de inclusões proteicas, constituídas maioritariamente por α-sinucleína, ubiquitina, neurofilamentos e chaperones moleculares. Estas inclusões são designadas por corpos de Lewy e pensa-se que a agregação que leva à sua formação está associada ao desenvolvimento de espécies intermediárias tóxicas para as células. Como mecanismo de proteção, os sistemas de defesa das células promovem a agregação destas espécies intermediárias, que são observáveis em amostras de tecido de cérebros de pacientes com a DP. Pensa-se que o aparecimento dos corpos de Lewy ocorre anos antes da morte dos neurónios dopaminérgicos, prevendo-se que o seu surgimento seja anterior ao desenvolvimento da fase sintomática da doença. O envelhecimento é caracterizado pela alteração de processos celulares, tais como aumento de danos mitocondriais, acumulação de espécies reativas de oxigénio e ainda pela regulação negativa dos mecanismos de homeostase proteica. Consequentemente, estes eventos podem levar à degenerescência das células neuronais e ao desenvolvimento de doenças neurodegenerativas. A família do co ativador 1 do recetor γ ativado por proliferadores de peroxissomas (PGC-1) é constituída por três membros fundadores: o PGC-1α, o PGC-1β e o co ativador relacionado com o PGC-1 (PRC). Tanto o PGC-1α como o PGC-1β podem apresentar funções complementares ou sobrepostas, essencialmente em tecidos oxidativos, como o cérebro, o coração, o tecido adiposo e o músculo esquelético. Por sua vez o PRC é expresso em todos os tecidos. O PGC-1α é um dos membros mais estudados da família do PGC-1, sendo induzido de uma forma especifica para cada tecido, em função de fatores como o exercício, o jejum e a exposiçãovii ao frio. Está ainda diretamente envolvido na biogénese mitocondrial e na destoxificação de espécies reativas de oxigénio. Este membro da família PGC-1 pode ser expresso sob a forma de diversas isoformas, que podem resultar na substituição do promotor do gene usado (proximal ou distante) e/ou de splicing alternativo, dependendo do estímulo ao qual a célula é sujeita. Cada isoforma pode apresentar funções distintas e ser específica de determinados tecidos. O PGC-1α1, inicialmente apenas conhecido como PGC-1α, foi a primeira isoforma a ser descoberta e corresponde ao transcrito canónico. Mais ainda, modificações pós-tradução, tais como a fosforilação, acetilação/deacetilação, SUMO-ilação e metilação, parecem estar envolvidas na modulação da atividade deste co ativador. Estudos revelaram uma redução da expressão do PGC-1α1 com o envelhecimento. Por outro lado, a sua ativação previne a perda de neurónios, em modelos celulares da DP. Outros estudos conseguiram ainda relacionar mutações genéticas, associadas ao desenvolvimento da DP, com a diminuição dos níveis de expressão do PGC-1α1. Mutações no gene da parquina, que levam à perda da sua função, podem promover a repressão da transcrição deste co ativador através da acumulação da PARIS, um substrato de interação com a parquina. Dado que não foram ainda identificados no PGC-1α1 domínios funcionais de ligação ao DNA nem a ligandos, a sua intervenção farmacológica torna-se um desafio. Assim, a estabilização deste co ativador poderá possibilitar o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas contra a neurodegenerescência. Através de um estudo realizado pelo Dr. Jorge Ruas e colaboradores, em que procederam à realização de um high-throughput screening, baseado em modelos celulares, foi identificado um grupo de compostos químicos com capacidade de ativar e estabilizar o PGC-1α1 em culturas de adipócitos do tecido adiposo castanho. A capacidade destes compostos para estabilizarem o PGC-1 foi avaliada através da medição dos níveis de expressão proteica deste co ativador, assim como dos níveis de expressão relativos do mRNA dos genes regulados pelo mesmo e ainda pela medição da respiração mitocondrial, no mesmo modelo celular. Desta forma, com base no estudo anterior, o objetivo do presente projeto assenta na validação, num sistema celular neuronal, de onze moléculas que foram previamente identificadas como estabilizadoras do PGC-1α1 e selecionadas para validação no sistema celular aqui descrito. O processo de validação foi decomposto em: seleção do modelo celular mais adequado; screening dos compostos, recorrendo a ensaios de viabilidade celular e à avaliação dos níveis de expressão relativos do mRNA de genes regulados pelo PGC-1α1; e à avaliação dos efeitos de cada composto selecionado, num modelo celular da DP. Nesta avaliação foram testados novamente os níveis de expressão relativos do mRNA de genes regulados pelo PGC-1α1 e outros fatoresviii como a influência destes compostos na viabilidade celular, nos níveis de produção de ATP e na produção de espécies reativas de oxigénio, no modelo celular da doença. A capacidade protetora destes compostos, face a um insulto com 1-metil-4-fenilpiridina (MPP+), nestas condições foi também avaliada. Dos onze compostos, cinco foram selecionados como moduladores efetivos de genes regulados pelo PGC-1α1, numa linha celular de neuroblastoma de ratinho (células N2a). Após pré- condicionamento das células com os compostos e tratamento com MPP+, alguns dos compostos selecionados promoveram o aumento dos níveis de ATP e de viabilidade celular, recuperando os níveis do controlo. Subsequentemente, alguns destes compostos mostraram ainda uma tendência para aumentar os níveis relativos de mRNA de genes como o da UCP1 (proteína desacopladora localizada nas mitocôndrias, que leva ao desacoplamento de eletrões da cadeia transportadora de eletrões e que, de entre as suas diversas funções se encontra envolvida na produção de calor, em adipócitos e na destoxificação de espécies reativas de oxigénio). O NRF- 1, associado à respiração mitocondrial e o Glut-4, membro dos transportadores de glucose, correspondem também a outras classes de genes que pareceram aumentar na presença de alguns dos compostos selecionados. Os resultados do presente estudo revelaram ainda que um pequeno grupo dos compostos testados parecem ter efeitos protetores em células tratadas com MPP+, possivelmente por promoverem a estabilização do PGC-1α1. No caso particular de um dos compostos testados, o PGC-1α1 parece ser ativado pela via do cAMP/p-CREB/CRE, uma das principais vias de ativação deste co ativador. Apesar de os outros compostos não terem demonstrado alterações nesta via, poderão estabilizar ou ativar o PGC-1α1 através de vias alternativas. Uma das hipóteses é que estes compostos possam promover modificações pós-tradução responsáveis por regular tanto a estabilidade como a função e localização deste co ativador. Dado que o mecanismo de ação destes compostos não é conhecido, é de extrema importância avaliar a sua capacidade de estabilizar o PGC-1α1 em diferentes sistemas celulares. Uma vez que a atividade biológica deste co ativador depende da presença de fatores de transcrição específicos, a sua estabilização pode não ser suficiente para a sua ativação nos diferentes sistemas celulares. Através dos diversos estudos que envolvem o PGC-1α tem-se vindo, cada vez mais a realçar o papel preponderante deste co ativador em diversos tecidos, com maior relevância para os tecidos oxidativos. Desta forma, encontrar compostos capazes de modular e estabilizar este co ativador, mantendo os seus níveis fisiológicos nestes tecidos é de extrema relevância, de formaix a possibilitar o desenvolvimento de estratégias terapêuticas comuns a patologias de diferentes origens, em que o PGC-1α poderá estar envolvido.
Descrição
Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2019
Palavras-chave
Parkinson’s disease MPP+ PGC-1α1 stabilizers Screening Teses de mestrado - 2019