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Publicação
A study on regeneration: insights from the zebrafish caudal fin and neural retina
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Resumo(s)
A regeneração é a capacidade que um organismo tem de recuperar totalmente, após uma lesão, a estrutura e função de um tecido, órgão ou membro danificado. Dado que os humanos não possuem grande capacidade regenerativa, estudos têm sido feitos no sentido de compreender quais os processos celulares e moleculares na base deste evento em organismos que possuem, naturalmente, capacidade de regenerar. Um dos modelos animais mais usados neste contexto é o peixe-zebra, Danio rerio. Este modelo animal possui a capacidade de regenerar a maioria dos seus órgãos e apêndices, e uma fácil manipulação genética, que permite criar linhas transgénicas e mutantes.
O peixe-zebra possui uma extraordinária capacidade de regenerar tecidos como a barbatana caudal e a retina. Após amputação da cauda, inicia-se um processo de cicatrização da ferida, onde esta é coberta por células da epiderme, seguida pela migração de células para o plano de amputação onde vão formar uma estrutura designada blastema, composta por células em proliferação que vão regenerar o tecido perdido. Por fim há uma fase de crescimento que é caracterizada por processos de diferenciação, de modo a restaurar a estrutura e função originais da cauda. Um dos tecidos mais abundantes na cauda é o tecido ósseo. O nosso grupo e outros demonstraram que a regeneração do tecido ósseo ocorre através da desdiferenciação dos osteoblastos maduros, que adquirem capacidade proliferativa e formam osteo-progenitores, capazes de se rediferenciar e regenerar o novo tecido ósseo. Contudo, um estudo recente demonstrou que após ablação dos osteoblastos presentes na cauda, a regeneração do osso progride normalmente, sugerindo a existência de outras fontes celulares capazes de originar novos osteoblastos nesta situação. Um dos possíveis candidatos são os pericitos, células perivasculares associadas aos vasos sanguíneos da barbatana caudal. Estas células partilham vários marcadores com células estaminais do mesênquima humanas e são capazes de originar osteoblastos in vitro. Assim sendo, um dos objetivos deste trabalho é explorar que tecidos, ou tipos celulares, têm a capacidade de originar osteoblasts in vivo durante o processo regenerativo, quando a população de osteoblastos residente está comprometida, com particular enfâse na população de pericitos.
A retina é o tecido do olho responsável por converter a luz em sinais químicos e transportá-los para o cérebro. Esta é composta por vários tipos celulares, entre eles as células Müller Glia, que após lesão da retina desdiferenciam, entrando em seguida no ciclo celular. Desta forma, produzem progenitores neurais que migram para a camada danificada e se diferenciam no tipo celular danificado. Contudo, como este processo regenerativo progride na ausência das células Müller Glia nunca foi estudado no peixe-zebra. É igualmente importante descobrir fatores que possam regular as várias etapas da regeneração da retina. Sabe-se que a via de sinalização Hippo está envolvida na regeneração de vários órgãos e estruturas. Dados preliminares do nosso grupo indicam também que o efetor desta via, Yap, está presente nas células Müller Glia durante o desenvolvimento larvar. Deste modo decidimos averiguar se a via de sinalização Hippo e o seu efetor Yap têm alguma função durante a regeneração da retina.
Assim, neste trabalho propusemos investigar por um lado como é que os tecidos da barbatana caudal respondem à ablação dos osteoblastos, e qual o papel dos pericitos e a sua contribuição para a regeneração desta estrutura; por outro criar uma linha de ablação de células Müller Glia que nos permitirá investigar como é que a regeneração da retina ocorre na ausência das mesmas; e se o Yap poderá ter alguma função durante o processo normal de regeneração da retina.
Observámos que, após amputação, em caudas desprovidas de osteoblastos, as regiões da epiderme e o mesênquima da barbatana caudal adjacentes à matriz óssea, são os primeiros tecidos a responder a este evento aumentando a proliferação celular e possivelmente originando novos progenitores osteogénicos, sugerindo o seu potencial como fontes osteogénicas durante a regeneração. Decidimos também averiguar o papel dos pericitos como uma possível fonte de osteoblastos durante a regeneração. Para isso, tentámos criar uma linha transgénica que permita a ablação específica desta população e outra linha para seguir permanentemente a linhagem celular dos pericitos. Para ambas as construções usámos um promotor específico das células que se pretende analisar, o promotor do gene sdf1α, que foi demonstrado marcar estas células na barbatana caudal. Para gerar a linha de ablação usámos como base o sistema NTR/Mtz, construindo um plasmídeo no qual a enzima NTR, que tem capacidade de induzir morte celular, está sob o controlo do promotor sdf1α. Apesar de duas tentativas diferentes de criar esta linha, nenhuma delas se verificou viável. De futuro teremos de pensar e adaptar estratégias mais eficientes para criar esta linha de ablação. Por outro lado, para criar uma linha para seguir a descendência dos pericitos usámos como base o sistema Cre/Lox. Com esse objetivo, construímos um plasmídeo onde o promotor do sdf1α controla a expressão da CreERT2 recombinase, induzível por tamoxifeno. Foi possível criar com êxito uma linha transgénica estável, Tg(sdf1α:CREERT2; Crya:VENUS), que foi cruzada com a linha Tg(β-actin2:loxP-DsRed-loxP-GFP) que irá permitir a marcação permanente e o seguimento dos pericitos e da sua descendência. Estas duas linhas servem para avaliar se esta população de células perivasculares é essencial e se contribui de alguma forma para o processo regenerativo, principalmente para a formação de novo tecido ósseo.
Relativamente ao estudo da regeneração da retina, decidimos criar uma linha de ablação das células Müller Glia, usando a mesma estratégia NTR/Mtz. Para tal, usámos o promotor do gene gfap, marcador de células Müller Glia diferenciadas, e tentámos gerar a linha gfap:GFP-NTR. Estamos atualmente a aguardar que os peixes cresçam para confirmar se algum poderá ser portador do transgene e deste modo estabelecer uma linha estável. Com o intuito de termos um ensaio que nos permitisse induzir regeneração na retina, implementámos no laboratório uma técnica já descrita que permite lesionar especificamente os fotorreceptores através de exposição à luz UV. Aplicámos esta técnica primeiro em peixes-zebra selvagem, onde verificámos a resposta regenerativa esperada, e em seguida à linha transgénica DN-yap na qual, após aplicação de choque térmico, se induz a expressão de uma forma negativa da proteína Yap. Infelizmente, os pontos temporais escolhidos para a recolha de tecido são ainda insuficientes para se conseguir observar uma possível perturbação no processo de regeneração dos fotorreceptores. Contudo, após choque-térmico, pudemos observar redução num marcador específico das células Müller Glia e a progressão no ciclo celular não parece ser afetada, sugerindo assim que o Yap não é necessário para a sua desdiferenciação e proliferação. Contudo, não podemos excluir a hipótese deste fator ser apenas necessário num ponto mais tardio da regeneração, por exemplo, durante a diferenciação dos fotorreceptores. Para isso teremos de fazer recolhas do tecido em períodos mais tardios durante o processo regenerativo.
Em conclusão, este trabalho apresenta principalmente resultados preliminares onde nos focámos na utilização e geração de linhas transgénicas, e no estudo de vias de sinalização, numa tentativa de identificar novos candidatos que possam auxiliar na regeneração do sistema esquelético e da retina, não só após lesão, mas também no contexto de patologias associadas a estes órgãos. Em mamíferos, estes sistemas estão desprovidos de capacidade regenerativa, podendo ser danificados e ficar com a sua função comprometida. Desta forma, é importante descobrir novos mecanismos celulares e moleculares que possam contribuir para o estabelecimento de novas terapias capazes de promover e induzir a capacidade regenerativa destas estruturas em mamíferos.
Regeneration is the capacity to fully restore the structure and function of an organ or limb, upon damage or injury. One of the most popular animal models used to study the mechanisms underlying tissue regeneration is the zebrafish, Danio rerio. Two tissues that hold an outstanding regenerative capacity are the caudal fin and the retina. Caudal fin skeletal tissue regeneration occurs via dedifferentiation of mature osteoblasts. However, upon osteoblast ablation, the regenerative process is not impaired, suggesting the existence of other cell sources capable of producing new osteoblasts. Possible candidates are the pericytes, shown to be capable of differentiating into osteoblasts in vitro. Upon injury in the neural retina, Müller Glia cells dedifferentiate and produce neuronal progenitors that allow damaged tissue recovery. However, how regeneration progresses in the absence of these cells has never been addressed, and the pathways that can modulate the process of retina regeneration are not fully understood. The Hippo pathway is a possible candidate to mediate retina regeneration, since it has an important role during the regeneration of several organs and recent data indicates that the Hippo pathway effector Yap is localized in the Müller Glia. Our results indicate that during fin regeneration, upon mature osteoblast ablation, the epidermis and the mesenchyme surrounding the bone matrix respond by increasing cell proliferating and by producing osteo-progenitors, suggesting that they could act as potential sources for de novo osteoblasts formation. In addition, to address if pericytes are a possible source of new osteoblasts, we tried to generate a pericyte ablation line, and succeeded in generating a pericyte-lineage tracing line. Regarding retina regeneration, in order to explore the role of Müller Glia during this process, we generated a Müller Glia cell ablation transgenic line, soon to be validated. To assess the contribution of Yap also in the context of retina regeneration, we induced photoreceptor damage in a Dominant Negative Yap transgenic zebrafish and observed no impairment until 6 days post injury, suggesting that Yap does not contribute towards dedifferentiation or proliferation of Müller Glia cells In this work, we focused on establishing transgenic lines and in assessing new pathways that could assist us in better understanding the regeneration of the skeletal tissue and neural retina. When these are damaged in mammals, in the context of osteo-degenerative disorders and retinopathies, both systems fail to regenerate properly, leading to severe impairment of normal tissue functions. It is therefore of major importance to unravel the cellular and molecular mechanism underlying tissue regeneration to promote more efficient therapeutic strategies to improve the regenerative capacity of these tissues in mammalian systems.
Regeneration is the capacity to fully restore the structure and function of an organ or limb, upon damage or injury. One of the most popular animal models used to study the mechanisms underlying tissue regeneration is the zebrafish, Danio rerio. Two tissues that hold an outstanding regenerative capacity are the caudal fin and the retina. Caudal fin skeletal tissue regeneration occurs via dedifferentiation of mature osteoblasts. However, upon osteoblast ablation, the regenerative process is not impaired, suggesting the existence of other cell sources capable of producing new osteoblasts. Possible candidates are the pericytes, shown to be capable of differentiating into osteoblasts in vitro. Upon injury in the neural retina, Müller Glia cells dedifferentiate and produce neuronal progenitors that allow damaged tissue recovery. However, how regeneration progresses in the absence of these cells has never been addressed, and the pathways that can modulate the process of retina regeneration are not fully understood. The Hippo pathway is a possible candidate to mediate retina regeneration, since it has an important role during the regeneration of several organs and recent data indicates that the Hippo pathway effector Yap is localized in the Müller Glia. Our results indicate that during fin regeneration, upon mature osteoblast ablation, the epidermis and the mesenchyme surrounding the bone matrix respond by increasing cell proliferating and by producing osteo-progenitors, suggesting that they could act as potential sources for de novo osteoblasts formation. In addition, to address if pericytes are a possible source of new osteoblasts, we tried to generate a pericyte ablation line, and succeeded in generating a pericyte-lineage tracing line. Regarding retina regeneration, in order to explore the role of Müller Glia during this process, we generated a Müller Glia cell ablation transgenic line, soon to be validated. To assess the contribution of Yap also in the context of retina regeneration, we induced photoreceptor damage in a Dominant Negative Yap transgenic zebrafish and observed no impairment until 6 days post injury, suggesting that Yap does not contribute towards dedifferentiation or proliferation of Müller Glia cells In this work, we focused on establishing transgenic lines and in assessing new pathways that could assist us in better understanding the regeneration of the skeletal tissue and neural retina. When these are damaged in mammals, in the context of osteo-degenerative disorders and retinopathies, both systems fail to regenerate properly, leading to severe impairment of normal tissue functions. It is therefore of major importance to unravel the cellular and molecular mechanism underlying tissue regeneration to promote more efficient therapeutic strategies to improve the regenerative capacity of these tissues in mammalian systems.
Descrição
Tese de mestrado em Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2016
Palavras-chave
Regeneração Osteoblastos Pericitos Células Müller Glia Yap Teses de mestrado - 2016