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Publication
Production of antimicrobial peptides by black soldier fly larvae supplemented with food industry waste
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Authors
Abstract(s)
O uso excessivo de antibióticos na produção de animais para consumo humano tem vindo a aumentar nos últimos anos, levando à investigação de soluções alternativas para combater este problema, como a utilização de péptidos antimicrobianos. Estes péptidos podem ser originários de várias fontes, uma delas os insetos, como é o caso das larvas da mosca soldado negro (Hermetia illucens) - “black soldier fly” (BSF). É uma espécie que já é usada na alimentação animal e caracteriza-se por ser uma boa alternativa a outras fontes de proteína pela sua composição nutricional. O facto de terem péptidos antimicrobianos na sua composição, faz destas larvas uma opção ainda mais vantajosa para a alimentação animal. Saliente-se ainda que a utilização desta espécie na produção de animais traz outros benefícios ao nível do aproveitamento de resíduos, pois estas larvas têm uma grande capacidade de converter uma vasta gama de materiais, nomeadamente resíduos da indústria alimentar, em proteína que é depois usada na alimentação animal. Assim, através das larvas de BSF, é possível estabelecer um ciclo de economia circular, em que os resíduos alimentares gerados pela população servem de alimento para as larvas, utilizadas na alimentação de animais destinados ao consumo humano. Desta forma, verifica-se que as larvas da mosca soldado negro são uma mais-valia quando incorporadas na alimentação animal, não só para os animais como ao nível da sustentabilidade.
Este trabalho teve como objetivo estudar o crescimento de larvas de BSF com diferentes substratos/resíduos derivados da indústria alimentar e os péptidos antimicrobianos produzidos, avaliando a sua capacidade antimicrobiana.
Numa primeira fase, foram realizados três ensaios de crescimento com larvas de BSF. No primeiro, foi avaliado quais os substratos que favorecem o crescimento das larvas, o segundo serviu para avaliar a influência da escala de crescimento e o terceiro foi uma otimização dos anteriores em que se fez crescimento das larvas com os melhores substratos e à escala mais adequada. No primeiro ensaio as larvas foram alimentadas com sete substratos diferentes, quatro incluíam resíduos industriais: pele de amendoim (Ps), manteiga de amendoim (Pb), ketchup (K) e maionese (M). Estes resíduos são purgas provenientes de indústrias alimentares portuguesas (Mendes Gonçalves e Prozis) que não podem ser usadas para alimentação humana e que, por isso, são um desperdício dessas indústrias. Além destes resíduos, utilizou-se também o bagaço de azeitona (Op) como base da maioria das dietas formuladas para este trabalho, que é um subproduto já utilizado pela EntoGreen (empresa fornecedora das larvas) para alimentação das mesmas. Assim, percebe-se que seria interessante do ponto de vista da sustentabilidade conseguir incorporar estes resíduos na dieta de larvas de BSF visto que esta espécie consegue utilizar uma vasta seleção de substratos e, adicionalmente, estudar a produção de péptidos antimicrobianos que poderão ser uma mais-valia para a alimentação animal.
Numa segunda fase, para avaliação da produção de péptidos, a hemolinfa foi recolhida das larvas no último instar da fase larvar e foram obtidos extratos (recorrendo ao uso metanol, ácido acético e água) dessas mesmas hemolinfas. Posteriormente, foi recolhida hemolinfa de larvas não infetadas e de larvas infetadas com S. aureus. Para observar o perfil proteico/peptídico, procedeu-se à quantificação proteica pelo método de Bradford e à realização de ensaios de eletroforese SDS-PAGE. A atividade antimicrobiana foi avaliada através de ensaios de concentração mínima inibitória (CMI). Os primeiros ensaios de CMI foram realizados contra S. aureus e nos restantes foram testadas as amostras contra E. coli, S. aureus e E. faecalis. Recorreu-se a HPLC-ESI-MS para a análise das hemolinfas obtidas de larvas alimentadas com bagaço de azeitona, manteiga de amendoim e pele de amendoim (OpPbPs).
Os resultados dos ensaios de crescimento indicaram que as larvas apresentaram um crescimento superior quando alimentadas com bagaço de azeitona e cereais, com a mistura incorporando o resíduo de manteiga de amendoim, com a mistura de cereais e água e a mistura de cereais, água e óleo de girassol. Estes quatro substratos foram os que revelaram ter a melhor combinação de vários fatores tais com o aporte nutricional, textura, temperatura, humidade e pH. A par disso, os resultados obtidos no último dia do ensaio de crescimento mostraram que com estes substratos, as larvas conseguiram chegar ao último instar da fase larvar, ou seja, o seu desenvolvimento era mais acentuado, quando comparado com os restantes substratos. Assim, foram estes os substratos escolhidos para se prosseguir os estudos.
Relativamente à análise da hemolinfa e dos respetivos extratos, a quantidade de proteína total foi superior na hemolinfa. O perfil de eletroforese revelou que as hemolinfas apresentavam maior quantidade de proteínas de peso molecular superior comparativamente aos extratos. Os diferentes substratos parecem não influenciar o perfil proteico/peptídico observado na eletroforese. Ao nível da atividade antimicrobiana contra S. aureus, apenas as amostras obtidas a partir de larvas suplementadas com OpC (bagaço de azeitona e cereais) e OpPbPs revelaram ter atividade inibitória, tendo sido estas as amostras selecionadas para os ensaios seguintes.
Para além destes testes, o ensaio realizado a uma escala diferente (caixas maiores) revelou que o crescimento das larvas é mais acentuado em escala maior mostrando que este também é um fator importante neste contexto. Além disso, a quantidade de proteína nas larvas que cresceram em maior escala também foi superior quando comparado com larvas de caixas pequenas. Tendo em conta estes resultados, fez-se um novo ensaio otimizado com larvas suplementadas com OpC e OpPbPs em que parte das larvas foram infetadas com S. aureus. Observou-se diferenças ao nível da quantidade de proteína total da hemolinfa que foi superior nas larvas infetadas. Quanto à atividade antimicrobiana, as amostras de larvas infetadas (tanto de OpC como de OpPbPs) revelaram inibição contra S. aureus, enquanto que das não infetadas, apenas a de OpPbPs inibiu o crescimento desta bactéria. Já contra E. faecalis, das quatro amostras testadas, houve uma que se destacou por apresentar atividade antimicrobiana que foi a hemolinfa de I_OpPbPs (larvas infetadas que foram alimentadas com mistura de bagaço de azeitona, manteiga de amendoim e pele de amendoim). No caso de E. coli, nenhuma das amostras inibiu o crescimento. Os resultados evidenciaram que as larvas infetadas têm maior atividade antimicrobiana e que tal facto pode ser devido à presença de peptidos antimicrobianos cuja sua produção pode ser induzida pela infeção. Pela análise de HPLC-ESI-MS das hemolinfas de larvas infetadas e não infetadas dos dois substratos, observou-se que as larvas infetadas de OpPbPs tinham um perfil ligeiramente diferente, com aparecimento de picos que não estão presentes nas restantes amostras, podendo isto estar relacionado com a atividade antimicrobiana. Estes resultados levaram a um novo teste antimicrobiano, em que houve um isolamento prévio de cada uma das bandas da amostra de hemolinfa de I_OpPbPs obtidas por eletroforese e foram testadas contra S. aureus. Dessas bandas, cinco delas revelaram inibição. Desta forma, fez-se uma análise por HPLC-ESI-MS destas cinco bandas para analisar o seu perfil cromatográfico. Os resultados demonstraram que dependendo da banda diferentes picos podem ser destacados, podendo estes estarem relacionados com a atividade antimicrobiana.
Para concluir, com este trabalho comprova-se que é possível utilizar resíduos da indústria alimentar, como a manteiga e a pele de amendoim, que juntamente com o bagaço de azeitona podem formar um substrato adequado para o crescimento das larvas, induzindo simultaneamente a produção de péptidos antimicrobianos nas mesmas. Desta forma, contribui-se para uma economia circular e, ao mesmo tempo, para a saúde animal ao incorporar farinhas com larvas de BSF na sua alimentação, com impacto positivo na saúde humana daqueles que consomem esses animais.
The excessive use of antibiotics in the production of animals for human has led to the development of microbial resistance and there is a dire need for solutions for this problem. Under that scope the scientific community has proposed alternatives including the use of antimicrobial peptides. These have various origins, one of which is insects, such as the black soldier fly (Hermetia illucens) (BSF), from where they can be extracted, more specifically from their larvae, which is already used to feed animals destined for human consumption. BSF larvae, in addition to being an interesting nutritional source for certain animals, are an even more advantageous alternative since they contain antimicrobial peptides. In addition, the use of BSF larvae for animal production brings other benefits in terms of waste utilisation, as these larvae have a great ability to convert a wide range of materials, particularly waste from the food industry, into protein that is then used in animal feed. Following this approach a circular economy strategy may be achieved. This work aimed to study the growth of BSF larvae with different food industry derived substrates/residues and the antimicrobial peptides produced by assessing its antimicrobial capacity. To achieve this, three growth trials were carried out with BSF larvae fed with seven different substrates, three of which included industrial waste. For peptide analysis, haemolymph was extracted from uninfected and infected larvae with S. aureus in the last instar of the larval stage. The haemolymph extracts were obtained by precipitation with organic solvents. To assess the protein profile, the protein was first quantified using the Bradford method, followed by SDS-PAGE electrophoresis assays. Antimicrobial activity was assessed using minimum inhibitory concentration (MIC) tests against E. coli, S. aureus and E. faecalis. HPLC-ESI-MS analysis was used to analyse the chromatographic profile of samples from infected and non-infected larvae. The results of the growth tests indicated that the larvae showed greater growth when fed with olive pomace and cereals and with the mixture incorporating peanut butter residue. The electrophoresis profiles showed no differences between the haemolymphs of the larvae fed with different substrates, and the same occurred between the extracts. In terms of antimicrobial activity, the results showed that this depends on infection of the larvae and the growth substrate selected. Higher antimicrobial activity was observed when larvae were infected and supplemented with olive pomace, peanut butter and peanut skin mixture. The haemolymph from last one was able to inhibit S. aureus and E. faecalis growth. According to the HPLC-ESI-MS results, the chromatogram of haemolymph of infected larvae fed with peanut butter-based substrate revealed a different profile. Thus, bands from this sample were submitted to SDS-Page and further analysed. Furthermore, it was possible identify some different peaks in some of the bands with antimicrobial activity. In conclusion, food industry waste, such as butter and peanut skins combined with olive pomace, can serve as a suitable substrate for BSF larvae growth while promoting antimicrobial peptide production. This approach supports a circular economy and enhances animal health, ultimately benefiting human health.
The excessive use of antibiotics in the production of animals for human has led to the development of microbial resistance and there is a dire need for solutions for this problem. Under that scope the scientific community has proposed alternatives including the use of antimicrobial peptides. These have various origins, one of which is insects, such as the black soldier fly (Hermetia illucens) (BSF), from where they can be extracted, more specifically from their larvae, which is already used to feed animals destined for human consumption. BSF larvae, in addition to being an interesting nutritional source for certain animals, are an even more advantageous alternative since they contain antimicrobial peptides. In addition, the use of BSF larvae for animal production brings other benefits in terms of waste utilisation, as these larvae have a great ability to convert a wide range of materials, particularly waste from the food industry, into protein that is then used in animal feed. Following this approach a circular economy strategy may be achieved. This work aimed to study the growth of BSF larvae with different food industry derived substrates/residues and the antimicrobial peptides produced by assessing its antimicrobial capacity. To achieve this, three growth trials were carried out with BSF larvae fed with seven different substrates, three of which included industrial waste. For peptide analysis, haemolymph was extracted from uninfected and infected larvae with S. aureus in the last instar of the larval stage. The haemolymph extracts were obtained by precipitation with organic solvents. To assess the protein profile, the protein was first quantified using the Bradford method, followed by SDS-PAGE electrophoresis assays. Antimicrobial activity was assessed using minimum inhibitory concentration (MIC) tests against E. coli, S. aureus and E. faecalis. HPLC-ESI-MS analysis was used to analyse the chromatographic profile of samples from infected and non-infected larvae. The results of the growth tests indicated that the larvae showed greater growth when fed with olive pomace and cereals and with the mixture incorporating peanut butter residue. The electrophoresis profiles showed no differences between the haemolymphs of the larvae fed with different substrates, and the same occurred between the extracts. In terms of antimicrobial activity, the results showed that this depends on infection of the larvae and the growth substrate selected. Higher antimicrobial activity was observed when larvae were infected and supplemented with olive pomace, peanut butter and peanut skin mixture. The haemolymph from last one was able to inhibit S. aureus and E. faecalis growth. According to the HPLC-ESI-MS results, the chromatogram of haemolymph of infected larvae fed with peanut butter-based substrate revealed a different profile. Thus, bands from this sample were submitted to SDS-Page and further analysed. Furthermore, it was possible identify some different peaks in some of the bands with antimicrobial activity. In conclusion, food industry waste, such as butter and peanut skins combined with olive pomace, can serve as a suitable substrate for BSF larvae growth while promoting antimicrobial peptide production. This approach supports a circular economy and enhances animal health, ultimately benefiting human health.
Description
Tese de mestrado, Qualidade Alimentar e Saúde, 2025, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.
Keywords
Antimicrobial peptides food residues Black soldier fly larvae Food residues Circular economy Teses de mestrado - 2025