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Publicação
New concept of immunotherapy for gene manipulation
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Resumo(s)
The knowledge of gene regulation led to the emergence of gene therapy as a versatile tool for the prevention and treatment of a variety of human diseases. New strategies for gene manipulation have been developed to date. Due to their innate ability to cross cell membranes and bind DNA in a specific and efficient manner, zinc-finger proteins possess a great potential for gene targeting and regulation. Although, zinc-fingers present the critical limitation of their low specificity to the target cells. Antibody fragments have demonstrated to have high specificity which make them a powerful tool to overcome this limitation presented by zinc-fingers. Within this context, this thesis aims to study the improvement of a previously studied therapeutic strategy of gene manipulation by antibody delivery of zinc-fingers. To validate our strategy and as a proof-of-concept, we choose HIV-1 as the disease model since Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS) is a disease which represent a major global public health issue. Therefore, we engineered four alternative bispecific proteins of an artificial zinc-finger (KRAB-HLTR3) designed to repress the transcription from the HIV-1 LTR promoter coupled to a CXCR4-specific nanobody (VHH). These proteins were successfully expressed and purified with high yields of soluble protein. Afterwards, we evaluated the proteins specificity and affinity to their targets and we demonstrated that these alternative bispecific proteins bind specifically to HLTR3 binding site in a concentration-dependent manner, similarly to previously studied proteins. We also demonstrated that these bispecific proteins bind specifically to CXCR4 receptor at the surface, similarly to previously studied proteins. Finally, we evaluated the bispecific proteins ability to repress transcription from the HIV-1 LTR promoter. We assessed repression of transcription of a destabilized green fluorescent protein (GFP) reporter and we demonstrated that these constructions repress transcription of GFP gene driven by the HIV-1 LTR promoter in a concentration-dependent manner, like to previously studied proteins. Although results suggest that zinc-finger on the C-terminal promote the binding to the HIV-1 LTR promoter and consequently the protein ability to repress viral transcription. With this in mind, more in vitro studies have to be performed to evaluate the bispecific proteins ability to repress transcription of the HIV-1 genome. In fact, since activation of the HIV-1 LTR promoter lead to expression of the HIV-1 genome, these results suggest that in the presence of the HIV-1 genome, these proteins inhibit the HIV-1 LTR promoter and consequently repress transcription of the HIV-1 genome. Additionally, to evaluate the repression of viral replication by these bispecific proteins, infection assays must be performed in Jurkat cell line or primary CD4+ T-lymphocytes. The infection can be performed with HIV-1 laboratory-adapted strains or HIV-1 primary isolates. In conclusion, results presented in this dissertation demonstrated that these therapeutic proteins improve the antibody delivery strategy to gene manipulation previously developed in our laboratory. In fact, these proteins are a promising tool to be applied in the clinical and might complement other gene-based strategies. Furthermore, these recombinant proteins can be designed and engineered to use in other therapeutic applications.
Nas últimas duas décadas, a terapia génica tem emergido como uma alternativa promissora para o tratamento de uma grande variedade de doenças. Esta terapia consiste na transferência de transgenes para células alvo, promovendo a correção de anormalidades no fenótipo ou genótipo dos pacientes. O crescente conhecimento da regulação génica, assim como da estrutura e função do genoma humano levaram ao aparecimento de novas estratégias para manipulação da expressão génica. O sucesso destas novas estratégias terapêuticas está intimamente relacionado com a escolha de sistemas de entrega de genes eficientes, específicos e não tóxicos. Até ao momento várias estratégias para manipulação génica foram desenvolvidas e testadas. As mais comuns incluem vetores virais e algumas formas de ADN não viral. O uso de vetores virais como veículos de transferência e expressão génica representa um poderoso instrumento, dada a capacidade que os vírus apresentam de penetrar dentro do núcleo das células hospedeiras e explorar a sua maquinaria celular. Entre os mais usados estão os vetores retrovirais, adenovirais e adeno-associados que apesentam alta eficiência de transfecção in vivo. No entanto, a elevada imunogenicidade, o limitante tamanho do transgene e ainda a produção de toxinas são alguns problemas destas estratégias. Relativamente às estratégias não virais, elas incluem inoculação de ADN puro ou encapsulado através de técnicas como microinjeção e electroporação. Os sistemas não virais representam uma importante alternativa aos virais, dada a sua menor imunogenicidade e não apresentarem limitações no tamanho do transgene. Apesar das suas vantagens, estes vetores apresentam uma transfecção menos eficiente comparativamente aos virais. Com o intuito de ultrapassar algumas limitações, quer dos vetores virais como dos não virais, as proteínas dedos de zinco (do inglês, zinc-finger proteins (ZFs)) surgiram como ferramentas versáteis para a terapia génica. Os ZFs apresentam uma capacidade inata para atravessar as membranas celulares e de se ligarem eficientemente e especificamente ao ADN. Desta forma, os ZFs podem ser desenhados para reconhecer uma vasta gama de sequência de ADN de modo a ativar, reprimir, XIV cortar ou colar genes. No entanto, apresentam ainda algumas limitações que devem ser ultrapassadas no futuro, em particular a sua baixa especificidade para as células alvo. Novas estratégias terapêuticas têm sido desenvolvidas de modo a ultrapassar esta limitação dos ZFs. De facto, dada a sua alta especificidade, os anticorpos monoclonais bem como pequenos derivados de anticorpos recombinantes têm demonstrado um enorme potencial para combater este problema dos ZFs. Neste contexto, este projeto científico tem como objetivo melhorar uma estratégia terapêutica de manipulação génica através da entrega de ZFs por anticorpos anteriormente desenvolvida no nosso laboratório. Como prova do conceito, escolhemos como modelo de doença o síndroma de imunodeficiência adquirida (SIDA), uma doença infeciosa de incidência mundial causada pelo vírus da imunodeficiência humana (VIH-1). A infeção pelo VIH-1 é caracterizada por uma supressão do sistema imunitário, levando ao aparecimento de doenças oportunistas. Este vírus tem a capacidade de infetar células CD4+ como é o caso dos linfócitos T e dos macrófagos. No entanto, não só o receptor celular CD4 permite a ligação e consequente entrada do vírus nas células alvo, o receptor de quimiocinas CXCR4 como também o CCR5 determinam também o tropismo celular do vírus. Apesar dos progressos realizados no tratamento da SIDA, especialmente através do uso de fármacos antirretrovirais (HAART), estes não são capazes de erradicar por completo o vírus do organismo. Deste modo, o desenvolvimento de novas estratégias contra o VIH-1, tal como a terapia génica, mostra especial interesse. Com este propósito, foram inicialmente construídas quatro proteínas biespecíficas variantes das já desenvolvidas no nosso laboratório, compostas por um anticorpo recombinante (VHH, também designado por nanobody) desenhado contra o receptor CXCR4 e um ZF com o domínio repressor KRAB desenhado para reprimir a transcrição do genoma do VIH-1 através da sua ligação ao promotor LTR do VIH-1 (KRAB-HLTR3). De forma a avaliar qual a conformação que proporciona uma maior estabilidade e solubilidade à proteína, uma das construções foi desenhada com o KRAB-HLTR3 a N-terminal, similarmente a uma das proteínas já desenvolvidas, enquanto nas outras três foi adicionado a C-terminal. Além disso, para facilitar a libertação do ZF nas células alvo, em duas construções foi introduzida a sequência de clivagem da catepsina B, uma cisteína proteinase lisossomal. Com o mesmo propósito, numa das construções foi introduzida a sequência de clivagem da MMP-9. Por outro lado, foi feita a construção de uma proteína que consiste apenas no KRAB-HLTR3 que foi gentilmente cedida pela C. Cunha-Santos (Laboratório João Gonçalves). Após a construção, todas as proteínas recombinantes foram clonadas no mesmo vector de expressão bacteriano, expressas em E. coli e posteriormente purificadas. Com exceção da construção que possui o sítio de clivagem da MMP-9, todas as outras foram purificadas com sucesso, sendo utilizadas nos ensaios seguintes. Seguidamente, para avaliar a capacidade de ligação de cada proteína biespecífica ao promotor LTR do VIH-1, foram realizados ensaios preliminares de ligação por ELISA, usando uma sequência de oligonucleótidos reconhecida pelo KRAB-HLTR3 como antigénio (sitio de ligação do HLTR3, do inglês HLTR3 binding site). Verificámos que estas proteínas recombinantes ligam especificamente ao sítio de ligação do HLTR3 e que esta ligação é dependente da concentração, o que se assemelha com as proteínas anteriormente estudadas. Sendo que as proteínas são biespecíficas foi necessário avaliar a funcionalidade dos dois domínios funcionais. Com este propósito, um ensaio de citometria de fluxo na linha celular Jurkat E6-1 T foi realizado e verificámos que estas proteínas recombinantes ligam especificamente à superfície do receptor CXCR4, similarmente ao observado com as proteínas já estudadas. De forma a validar a capacidade das proteínas biespecíficas de reprimir a transcrição viral através do promotor LTR do VIH-1, foi avaliada a repressão da transcrição de um gene repórter, nomeadamente a GFP (do inglês green fluorescent protein) conduzido pelo promotor LTR do VIH-1. Ensaios de citometria de fluxo foram realizados na linha celular HeLa-Tat-III/LTR/d1EGFP e verificámos que estas proteínas biespecíficas reprimem a transcrição do gene da GFP e que esta repressão é dependente da concentração, o que se assemelha com as proteínas estudadas anteriormente. Verificámos no entanto que as construções que possuem o KRAB-HLTR3 a C-terminal apresentam uma maior capacidade de repressão da transcrição. Uma vez que a ativação do promotor LTR do VIH-1 leva à expressão do genoma do VIH-1, estes resultados sugerem que na presença do genoma do VIH-1 é possível inibir o promotor LTR e consequentemente reprimir a transcrição do genoma do VIH-1. Simultaneamente, e dado ao facto dos fragmentos de anticorpos exibirem algumas limitações farmacocinéticas, outra estratégia terapêutica foi desenvolvida. Desta forma, construímos três proteínas biespecíficas compostas por um anticorpo monoclonal desenhado contra o receptor HER2 (Trastuzumab, Herceptin®) acoplado a um ZF com o domínio repressor KRAB desenhado para se ligar ao promotor do protooncogene erbB-2/HER-2. Para facilitar a libertação do ZF nas células alvo, numa das construções foi introduzida a sequência de clivagem da catepsina B e noutra construção a sequência de clivagem da MMP-9. Os resultados dos ensaios preliminares de transfecção mostraram que à exceção da construção que possui a sequência da MMP-9, as restantes duas foram construídas e expressas na linha celular HEK293T com sucesso. Em conclusão, os resultados apresentados neste projeto científico demonstraram que estas proteínas biespecíficas melhoram a estratégia terapêutica de manipulação génica anteriormente desenvolvida no nosso laboratório. De facto, estas proteínas biespecíficas apresentam um enorme potencial para serem aplicadas na clinica. Como perspetivas futuras, mais ensaios de citometria de fluxo na linha celular Jurkat E6-1 T são necessários de forma a avaliar a internalização das proteínas biespecíficas via CXCR4. Além disso, para validar que a ligação e a internalização das proteínas ocorre efetivamente via CXCR4, os mesmos ensaios terão de ser realizados na linha celular Jurkat CXCR4 negativas. Por outro lado, para avaliar a influência da catepsina B na libertação do ZF, ensaios funcionais deverão ser realizados. Relativamente à capacidade das proteínas biespecíficas de reprimirem a transcrição do genoma do VIH-1 através da inibição do promotor LTR, terão de ser realizados ensaios in vitro numa linha celular que integre o genoma do VIH-1. Adicionalmente para avaliar a repressão da replicação viral por estas proteínas biespecíficas, ensaios de infeção deverão ser feitos na linha celular Jurkat ou em linfócitos primários.
Nas últimas duas décadas, a terapia génica tem emergido como uma alternativa promissora para o tratamento de uma grande variedade de doenças. Esta terapia consiste na transferência de transgenes para células alvo, promovendo a correção de anormalidades no fenótipo ou genótipo dos pacientes. O crescente conhecimento da regulação génica, assim como da estrutura e função do genoma humano levaram ao aparecimento de novas estratégias para manipulação da expressão génica. O sucesso destas novas estratégias terapêuticas está intimamente relacionado com a escolha de sistemas de entrega de genes eficientes, específicos e não tóxicos. Até ao momento várias estratégias para manipulação génica foram desenvolvidas e testadas. As mais comuns incluem vetores virais e algumas formas de ADN não viral. O uso de vetores virais como veículos de transferência e expressão génica representa um poderoso instrumento, dada a capacidade que os vírus apresentam de penetrar dentro do núcleo das células hospedeiras e explorar a sua maquinaria celular. Entre os mais usados estão os vetores retrovirais, adenovirais e adeno-associados que apesentam alta eficiência de transfecção in vivo. No entanto, a elevada imunogenicidade, o limitante tamanho do transgene e ainda a produção de toxinas são alguns problemas destas estratégias. Relativamente às estratégias não virais, elas incluem inoculação de ADN puro ou encapsulado através de técnicas como microinjeção e electroporação. Os sistemas não virais representam uma importante alternativa aos virais, dada a sua menor imunogenicidade e não apresentarem limitações no tamanho do transgene. Apesar das suas vantagens, estes vetores apresentam uma transfecção menos eficiente comparativamente aos virais. Com o intuito de ultrapassar algumas limitações, quer dos vetores virais como dos não virais, as proteínas dedos de zinco (do inglês, zinc-finger proteins (ZFs)) surgiram como ferramentas versáteis para a terapia génica. Os ZFs apresentam uma capacidade inata para atravessar as membranas celulares e de se ligarem eficientemente e especificamente ao ADN. Desta forma, os ZFs podem ser desenhados para reconhecer uma vasta gama de sequência de ADN de modo a ativar, reprimir, XIV cortar ou colar genes. No entanto, apresentam ainda algumas limitações que devem ser ultrapassadas no futuro, em particular a sua baixa especificidade para as células alvo. Novas estratégias terapêuticas têm sido desenvolvidas de modo a ultrapassar esta limitação dos ZFs. De facto, dada a sua alta especificidade, os anticorpos monoclonais bem como pequenos derivados de anticorpos recombinantes têm demonstrado um enorme potencial para combater este problema dos ZFs. Neste contexto, este projeto científico tem como objetivo melhorar uma estratégia terapêutica de manipulação génica através da entrega de ZFs por anticorpos anteriormente desenvolvida no nosso laboratório. Como prova do conceito, escolhemos como modelo de doença o síndroma de imunodeficiência adquirida (SIDA), uma doença infeciosa de incidência mundial causada pelo vírus da imunodeficiência humana (VIH-1). A infeção pelo VIH-1 é caracterizada por uma supressão do sistema imunitário, levando ao aparecimento de doenças oportunistas. Este vírus tem a capacidade de infetar células CD4+ como é o caso dos linfócitos T e dos macrófagos. No entanto, não só o receptor celular CD4 permite a ligação e consequente entrada do vírus nas células alvo, o receptor de quimiocinas CXCR4 como também o CCR5 determinam também o tropismo celular do vírus. Apesar dos progressos realizados no tratamento da SIDA, especialmente através do uso de fármacos antirretrovirais (HAART), estes não são capazes de erradicar por completo o vírus do organismo. Deste modo, o desenvolvimento de novas estratégias contra o VIH-1, tal como a terapia génica, mostra especial interesse. Com este propósito, foram inicialmente construídas quatro proteínas biespecíficas variantes das já desenvolvidas no nosso laboratório, compostas por um anticorpo recombinante (VHH, também designado por nanobody) desenhado contra o receptor CXCR4 e um ZF com o domínio repressor KRAB desenhado para reprimir a transcrição do genoma do VIH-1 através da sua ligação ao promotor LTR do VIH-1 (KRAB-HLTR3). De forma a avaliar qual a conformação que proporciona uma maior estabilidade e solubilidade à proteína, uma das construções foi desenhada com o KRAB-HLTR3 a N-terminal, similarmente a uma das proteínas já desenvolvidas, enquanto nas outras três foi adicionado a C-terminal. Além disso, para facilitar a libertação do ZF nas células alvo, em duas construções foi introduzida a sequência de clivagem da catepsina B, uma cisteína proteinase lisossomal. Com o mesmo propósito, numa das construções foi introduzida a sequência de clivagem da MMP-9. Por outro lado, foi feita a construção de uma proteína que consiste apenas no KRAB-HLTR3 que foi gentilmente cedida pela C. Cunha-Santos (Laboratório João Gonçalves). Após a construção, todas as proteínas recombinantes foram clonadas no mesmo vector de expressão bacteriano, expressas em E. coli e posteriormente purificadas. Com exceção da construção que possui o sítio de clivagem da MMP-9, todas as outras foram purificadas com sucesso, sendo utilizadas nos ensaios seguintes. Seguidamente, para avaliar a capacidade de ligação de cada proteína biespecífica ao promotor LTR do VIH-1, foram realizados ensaios preliminares de ligação por ELISA, usando uma sequência de oligonucleótidos reconhecida pelo KRAB-HLTR3 como antigénio (sitio de ligação do HLTR3, do inglês HLTR3 binding site). Verificámos que estas proteínas recombinantes ligam especificamente ao sítio de ligação do HLTR3 e que esta ligação é dependente da concentração, o que se assemelha com as proteínas anteriormente estudadas. Sendo que as proteínas são biespecíficas foi necessário avaliar a funcionalidade dos dois domínios funcionais. Com este propósito, um ensaio de citometria de fluxo na linha celular Jurkat E6-1 T foi realizado e verificámos que estas proteínas recombinantes ligam especificamente à superfície do receptor CXCR4, similarmente ao observado com as proteínas já estudadas. De forma a validar a capacidade das proteínas biespecíficas de reprimir a transcrição viral através do promotor LTR do VIH-1, foi avaliada a repressão da transcrição de um gene repórter, nomeadamente a GFP (do inglês green fluorescent protein) conduzido pelo promotor LTR do VIH-1. Ensaios de citometria de fluxo foram realizados na linha celular HeLa-Tat-III/LTR/d1EGFP e verificámos que estas proteínas biespecíficas reprimem a transcrição do gene da GFP e que esta repressão é dependente da concentração, o que se assemelha com as proteínas estudadas anteriormente. Verificámos no entanto que as construções que possuem o KRAB-HLTR3 a C-terminal apresentam uma maior capacidade de repressão da transcrição. Uma vez que a ativação do promotor LTR do VIH-1 leva à expressão do genoma do VIH-1, estes resultados sugerem que na presença do genoma do VIH-1 é possível inibir o promotor LTR e consequentemente reprimir a transcrição do genoma do VIH-1. Simultaneamente, e dado ao facto dos fragmentos de anticorpos exibirem algumas limitações farmacocinéticas, outra estratégia terapêutica foi desenvolvida. Desta forma, construímos três proteínas biespecíficas compostas por um anticorpo monoclonal desenhado contra o receptor HER2 (Trastuzumab, Herceptin®) acoplado a um ZF com o domínio repressor KRAB desenhado para se ligar ao promotor do protooncogene erbB-2/HER-2. Para facilitar a libertação do ZF nas células alvo, numa das construções foi introduzida a sequência de clivagem da catepsina B e noutra construção a sequência de clivagem da MMP-9. Os resultados dos ensaios preliminares de transfecção mostraram que à exceção da construção que possui a sequência da MMP-9, as restantes duas foram construídas e expressas na linha celular HEK293T com sucesso. Em conclusão, os resultados apresentados neste projeto científico demonstraram que estas proteínas biespecíficas melhoram a estratégia terapêutica de manipulação génica anteriormente desenvolvida no nosso laboratório. De facto, estas proteínas biespecíficas apresentam um enorme potencial para serem aplicadas na clinica. Como perspetivas futuras, mais ensaios de citometria de fluxo na linha celular Jurkat E6-1 T são necessários de forma a avaliar a internalização das proteínas biespecíficas via CXCR4. Além disso, para validar que a ligação e a internalização das proteínas ocorre efetivamente via CXCR4, os mesmos ensaios terão de ser realizados na linha celular Jurkat CXCR4 negativas. Por outro lado, para avaliar a influência da catepsina B na libertação do ZF, ensaios funcionais deverão ser realizados. Relativamente à capacidade das proteínas biespecíficas de reprimirem a transcrição do genoma do VIH-1 através da inibição do promotor LTR, terão de ser realizados ensaios in vitro numa linha celular que integre o genoma do VIH-1. Adicionalmente para avaliar a repressão da replicação viral por estas proteínas biespecíficas, ensaios de infeção deverão ser feitos na linha celular Jurkat ou em linfócitos primários.
Descrição
Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2016
Palavras-chave
Gene therapy Zinc-fingers proteins Antibody engineering Antibody Delivery Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Teses de mestrado - 2016